一种基于结构转换信号适配体探针及其在吡虫啉检测中的应用

本发明属于核酸探针，具体涉及一种基于结构转换信号适配体探针及其在吡虫啉检测中的应用。

背景技术：

1、吡虫啉（imidacloprid）作为第一代新烟碱类杀虫剂，因其广谱、高效、内吸性强等特点，已成为全球农业生产中防治刺吸式口器害虫的常用药剂。然而，大量研究表明，吡虫啉对蜜蜂等非靶标授粉昆虫具有亚致死效应，且其代谢产物在土壤和水体中残留周期较长。长期暴露于吡虫啉残留可能干扰生态系统稳定性，并可能通过食物链累积对人体神经系统产生潜在危害。因此，实现环境与农产品中吡虫啉残留的快速、灵敏、现场检测，对保障食品安全与生态安全具有重要意义。

2、目前，吡虫啉的常规检测方法主要分为两类：一类是仪器分析方法，包括高效液相色谱（hplc）、液相色谱-串联质谱（lc-ms/ms）等。该类方法灵敏度高、准确性好，可作为确证性检测手段，但存在仪器昂贵、操作专业、样品前处理繁琐、耗时长且难以现场实时检测的固有局限。另一类是免疫分析方法，如酶联免疫吸附测定（elisa）。虽然免疫法具有相对快速、成本较低的优势，但抗体制备周期长、动物免疫批次差异明显、热稳定性差，且针对小分子农药需要半抗原偶联，易出现交叉反应率控制不佳的问题。

3、核酸适配体（aptamer）是一类通过体外指数富集配体系统进化技术（selex）筛选获得的单链dna或rna分子，能够通过折叠形成特定三维结构以高亲和力、高特异性结合靶标分子。与抗体相比，核酸适配体具有化学合成简便、热稳定性高、批次间一致性佳、易于位点特异性修饰（如荧光基团、猝灭基团、生物素或纳米材料）等显著优势。因此，基于适配体的生物传感器在农药残留快速检测领域展现出广阔的应用前景。

4、尽管已有少量针对新烟碱类农药的适配体报道，但专门识别吡虫啉的高亲和力、低交叉反应的功能核酸序列仍然十分有限。现有吡虫啉适配体存在以下一个或多个问题：亲和力不足（解离常数kd值在µm级别）、对结构类似物（如噻虫嗪、啶虫脒、烯啶虫胺）选择性差、信号输出稳定性不佳，或尚未被有效整合为简便、无需分离、适用于现场检测的探针体系。

技术实现思路

1、鉴于此，本研究旨在设计一种基于结构转换信号的功能核酸适配体探针，以实现对吡虫啉的特异性识别与高灵敏检测。为实现这一目标，我们采用文库固定化的筛选策略，通过体外进化筛选出一条具备荧光信号转换能力的核酸适配体。该适配体的一端修饰有羧基荧光素（fam）荧光基团。在无吡虫啉存在的情况下，适配体与琥珀酰亚胺酯（dabcyl）标记的反义dna互补配对，形成稳定的双链结构，此时，dabcyl基团靠近fam基团，荧光发生有效猝灭。当体系中存在吡虫啉时，适配体优先与吡虫啉特异性结合，导致dabcyl标记的反义dna被竞争性置换而脱离，fam基团远离dabcyl，荧光信号得以恢复并显著增强。通过上述机制，实现了对吡虫啉的灵敏检测。

2、为实现上述目的，本申请提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种基于结构转换信号适配体探针，所述适配体探针的核苷酸序列如seq id no.6所示。

4、第二方面，本发明提供一种结构转换信号分子，所述信号分子由所述的适配体探针、fdna、qdna组成；所述fdna的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述qdna的核苷酸序列如seq id no.8所示。

5、基于上述技术方案，进一步地，所述fdna的5’端标记荧光基团。

6、基于上述技术方案，进一步地，所述荧光基团为fam。

7、基于上述技术方案，进一步地，所述qdna的3’端标记淬灭基团。

8、基于上述技术方案，进一步地，所述淬灭基团为dabcyl。

9、第三方面，本发明提供一种吡虫啉检测试剂盒，包括所述的适配体探针或所述的结构转换信号分子。

10、基于上述技术方案，进一步地，所述检测试剂盒中包括辅助因子，所述辅助因子为mg2+和na+。

11、第四方面，本发明提供一种所述的适配体探针或所述的结构转换信号分子或所述的检测试剂盒在生物传感方面的应用，用于特异性识别吡虫啉。

12、基于上述技术方案，进一步地，所述适配体探针在特异性识别吡虫啉时的条件为：ph为7~8，室温，mg2+、na+作为辅助因子。

13、基于上述技术方案，进一步地，所述吡虫啉的线性响应浓度范围为0-200 nm。

14、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

15、（1）本发明获得了一条结构转换适配体探针，适配体探针分子信号随时间的延长而增加。

16、（2）本发明提供的适配体探针稳定性好，灵敏度高，特异性好，可以在生物传感应用方面发挥优势。

1.一种基于结构转换信号适配体探针，其特征在于，所述适配体探针的核苷酸序列如seq id no.6所示。

2.一种结构转换信号分子，其特征在于，所述信号分子由权利要求1所述的适配体探针、fdna、qdna组成；所述fdna的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述qdna的核苷酸序列如seq id no.8所示。

3.根据权利要求2所述的结构转换信号分子，其特征在于，所述fdna的5’端标记荧光基团；所述荧光基团为fam。

4.根据权利要求2所述的结构转换信号分子，其特征在于，所述qdna的3’端标记淬灭基团；所述淬灭基团为dabcyl。

5.一种吡虫啉检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的适配体探针或权利要求2~4任一项所述的结构转换信号分子。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括辅助因子，所述辅助因子为mg2+和na+。

7.权利要求1所述的适配体探针或权利要求2~4任一项所述的结构转换信号分子或权利要求5~6任一项所述的检测试剂盒在生物传感方面的应用，其特征在于，用于特异性识别吡虫啉。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述适配体探针在特异性识别吡虫啉时的条件为：ph为7~8，室温，mg2+、na+作为辅助因子。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述吡虫啉的线性响应浓度范围为0-200nm。