基于分裂式crRNA-Cas12a体系的miR-192可视化直接检测方法

本发明涉及免扩增、快速poct分子诊断，具体涉及基于分裂式crrna-cas12a体系的mir-192可视化直接检测方法。

背景技术：

1、随着分子生物学技术不断发展，非编码rna在肿瘤发生发展中的调控作用逐渐成为肿瘤领域的研究热点。微小rna（mirna）作为一类长度约22个核苷酸的小分子非编码rna，可在转录后水平调控下游靶基因表达，广泛参与肿瘤细胞增殖、侵袭转移、上皮间质转化、血管生成及化疗耐药等全过程，是极具临床转化价值的肿瘤分子标志物与治疗靶点。mirna主要依靠自身7-8个核苷酸的种子序列结合靶mrna的3'非翻译区，进而调控mrna稳定性与蛋白翻译过程，调控机制明确且表达具备组织特异性，适合作为临床无创或微创检测指标。

2、mir-192是一类定位在人类11q13.1染色体的关键mirna分子，具备完整且规范的成熟合成通路：由rna聚合酶转录形成初级转录本后，经drosha-dgcr8复合体、dicer酶逐步剪切加工，最终形成成熟的mir-192-5p引导链与mir-192-3p随从链。区别于多数mirna仅单条链具备生物学功能，mir-192的两条链均可靶向肿瘤关键致病基因，全方位调控肿瘤恶性生物学行为。现有研究证实，mir-192在肝癌、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中呈现异常表达状态，且具备癌种依赖性的双重生物学功能，既可发挥促癌作用，也可表现为抑癌效应，在肿瘤发生、进展及转移全过程中扮演关键角色。

3、但目前关于mir-192的相关研究仍存在明显局限性：现有研究大多聚焦单一靶基因或单一信号通路开展机制验证，尚未系统阐明mir-192在肿瘤复杂信号网络中的调控机制，同时其在不同癌种中功能差异的底层原因、临床表达阈值、诊断及预后临界值均无统一结论。基于此，开展精准、标准化的mir-192表达水平检测，明确其在不同肿瘤、不同疾病分期中的表达特征，能够弥补现有肿瘤分子诊断体系的短板，厘清其肿瘤调控机制，同时挖掘其作为癌症早期诊断、预后评估生物标志物以及新型治疗靶点的临床价值，为肿瘤精准诊疗提供全新的实验依据与临床参考。现有技术中，cn202610046304.4公开了调控crispr/cas12a反式切割活性的一锅法检测方法，其侧重于反式切割活性的通用调控，cn202511635152.3公开了一种利用cas12a酶和cas9酶选择反切活性的一管式双基因检测方法，其侧重于cas12a与cas9双酶的选择性切割；cn202510960176.x公开了基于crispr-cas12a与分裂dnazyme偶联的mirna检测系统及检测方法，其依赖的是分裂dnazyme（脱氧核酶），以上检测系统依赖于完整的crrna（crispr rna）来引导cas12a蛋白识别目标序列，且检测rna（如mirna）时往往需要繁琐的逆转录或核酸扩增步骤，无法有效区分同源microrna，易出现交叉识别造成的假阳性，体液复杂基质下mir-192微量检测特异性不足，需提供一种新的mir-192可视化直接检测方法。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供基于分裂式crrna-cas12a体系的mir-192可视化直接检测方法，能够解决现有技术中存在的检测系统依赖于完整的crrna来引导cas12a蛋白识别目标序列且检测rna时需要繁琐的逆转录或核酸扩增步骤、无法有效区分同源microrna、易出现交叉识别造成的假阳性、体液复杂基质下mir-192微量检测特异性不足的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：基于分裂式crrna-cas12a体系的mir-192可视化直接检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

3、s1、预组装休眠复合物：将cas12a蛋白、分裂式crrna以及人工设计的靶向mir-192的dna序列预先孵育结合，形成休眠状态的cas核糖核蛋白复合物；所述分裂式crrna由支架rna和间隔rna两个独立片段组成，所述靶向mir-192的dna序列与间隔rna互补；

4、s2、靶标特异性激活：向休眠状态的cas核糖核蛋白复合物体系中加入含有mir-192靶标的待测样本，所述mir-192靶标与dna序列发生特异性碱基互补配对，碱基互补配对后构象发生改变，解除所述cas12a蛋白的抑制状态，激活cas12a蛋白非特异性反式切割活性，该活性不依赖靶标序列，无差别切割体系内所有单链核酸；

5、s3、荧光信号释放与定量检测：所述cas核糖核蛋白复合物体系中还包含单链dna报告探针，所述单链dna报告探针的两端分别标记有荧光基团f与淬灭基团q；

6、在cas12a蛋白反式切割活性激活后，所述cas12a蛋白无差别随机切割所述单链dna报告探针，使荧光基团f与淬灭基团q空间分离，荧光信号恢复；通过检测荧光强度实现对样本中mir-192的定量检测。

7、进一步地，所述单链dna报告探针在静息状态下，通过自身序列互补缠绕，使荧光基团f与淬灭基团q处于极近距离而发生荧光共振能量转移，实现荧光淬灭，体系无荧光信号。

8、进一步地，所述cas12a蛋白为ascas12a、lbcas12a或lbacas12a中的任意一种。

9、进一步地，所述步骤s1中，cas12a蛋白、分裂式crrna以及人工设计的靶向mir-192的dna序列在缓冲液nebuffer中进行混合，漩涡震荡5分钟，37℃下恒温培养箱孵育30分钟，实现孵育结合。

10、一种用于基于分裂式crrna-cas12a体系的mir-192可视化直接检测方法的试剂盒，其特征在于：包括以下组分：

11、cas12a蛋白；

12、分裂式crrna，所述分裂式crrna由支架rna和间隔rna；

13、靶向mir-192的dna序列，所述靶向mir-192的dna序列包含与所述间隔rna互补的序列以及与所述mir-192互补的序列；

14、单链dna报告探针，所述单链dna报告探针标记有荧光基团f与淬灭基团q。

15、本发明的优点在于：通过利用靶标mir-192与分裂式crrna互补配对，解除cas12a蛋白的构象抑制，激活其反式旁切活性；通过切割荧光-淬灭双标记dna报告探针产生荧光信号，完成对mir-192的定量检测，实现等温一步反应，单个mir-192分子激活cas后，可持续切割数十上百条荧光报告探针，实现信号级联放大，满足低拷贝微量mir-192样本检测，突破现有mirna检测技术的操作壁垒；

16、通过分裂式crrna依靠碱基互补精准匹配mir-192的种子序列，能够有效区分同源microrna，降低交叉识别造成的假阳性，解决体液复杂基质下mir-192微量检测特异性不足的问题，提升mir-192检测的特异性与抗干扰能力；

17、本发明为面向临床开发适配poct的分子诊断工具，针对肿瘤标志物mir-192的临床检测需求，构建简便、快速、低成本的传感检测体系，无需反转录、pcr扩增，无需复杂核酸扩增设备，可直接用于血液等临床样本中mir-192含量测定，荧光信号可通过便携式荧光成像仪读取，适配诊断标志物快速评估，用于癌症mir-192表达水平筛查与预后判断，为癌症早期筛查、预后评估提供新型即时检测技术。