具备抗氧化活性的大西洋鲑肽及其筛选方法与应用与流程

本发明涉及生物，具体为具备抗氧化活性的大西洋鲑肽及其筛选方法与应用。

背景技术：

1、氧化应激是自由基产生与清除失衡导致的机体损伤状态，与衰老、炎症、细胞凋亡及多种慢性疾病密切相关。开发安全、高效、天然的抗氧化剂是生物医药、功能食品领域的研究热点。dha（二十二碳六烯酸）作为重要的omega3 多不饱和脂肪酸，在脑功能、视觉发育、心血管调节等生理活动中发挥关键作用，但其分子含多个不饱和双键，化学性质极不稳定，易受氧气、光照、温度等因素诱导氧化酸败，限制了其应用场景。

2、目前合成抗氧化剂存在潜在安全风险；天然提取物存在相容性差、批次不稳定、功能单一等问题。活性多肽具有结构明确、活性可控、安全性高、易修饰等优势，部分多肽可通过清除自由基、保护细胞结构发挥抗氧化作用，同时部分多肽可与脂质形成稳定复合物，实现脂质稳定化。开发兼具高效抗氧化活性、线粒体保护功能，且能与脂质特异性结合的多肽，是生物医药与功能制剂领域的重要发展方向。

3、现有抗氧化肽筛选多采用随机酶解+活性追踪，无靶向性，无法富集与脂质特异性结合的肽段，且对低丰度高活性肽的捕获效率低；同时尚未见来源于大西洋鲑、兼具高效抗氧化、线粒体保护双重功能，且能与 dha 特异性结合的多肽序列及标准化制备技术报道，也缺乏相关分子互作机制的系统研究。本发明建立了亲和纯化结合无偏倚蛋白质组学的专属筛选方法，靶向筛选大西洋鲑源高活性抗氧化肽，应用固相合成工艺，实现该肽的标准化制备，填补了该领域的技术空白。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供具备抗氧化活性的大西洋鲑肽；第二目的在于提供具备抗氧化活性的大西洋鲑肽的筛选方法；第三目的在于提供具备抗氧化活性的大西洋鲑肽的应用，解决现有抗氧化肽筛选效率低、靶向性差，以及抗氧化技术存在的安全性、稳定性、功能单一等问题；同时通过分子模拟技术，解析该抗氧化活性肽与 dha 的相互作用模式及稳定化机制，为其拓展应用提供理论依据。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供具备抗氧化活性的大西洋鲑肽，所述大西洋鲑肽的氨基酸序列选自seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seqid no.7或seq id no.8所示多肽中的一种或多种组合；其中，序列如seq id no.2、seq idno.4、seq id no.8所示多肽分别与 dha 特异性结合。

4、本发明还提供编码如上所述的大西洋鲑肽的核酸。

5、本发明还提供含如上所述的核酸的表达载体。

6、本发明还提供含如上所述的表达载体的重组细胞，所述重组细胞包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系。

7、本发明还提供具备抗氧化活性的大西洋鲑肽的筛选方法，包括如下步骤：

8、（1）构建分子标签：基于生物素与链霉亲和素的特异性相互作用，通过化学合成方式，在磷脂头部基团上共价连接生物素，构建分子钓钩系统；所述分子钓钩系统包括三种具有不同脂肪酸链组合的生物素标记的探针，分别为含双饱和脂肪酸链、饱和/多不饱和混合脂肪酸链以及双多不饱和脂肪酸链的生物素化磷脂；

9、（2）多肽获取：取大西洋鲑鱼肌肉组织作为原料，经研磨、组织裂解、离心后收集上清液，采用胰蛋白酶对上清液中蛋白质进行酶解，获得多肽混合液；

10、（3）孵育与亲和捕获：设置实验组与对照组，其中实验组为步骤（1）中所述三种具有不同脂肪酸链组合的生物素标记的探针，对照组为溶剂空白对照组及游离生物素对照组，以排除非特异性结合的蛋白；将各组分别与步骤（2）获得的多肽混合液混合并进行孵育；随后加入链霉亲和素琼脂珠对多肽进行捕获，采用含0.3%吐温的磷酸缓冲盐溶液pbst洗涤5次，洗涤后得到捕获的多肽；

11、（4）质谱分析：将捕获的多肽进行液相色谱 - 串联质谱分析，基于uniprot数据库，通过肽质量指纹图谱匹配进行序列鉴定；

12、（5）多肽功能预测与抗氧化活性肽筛选：根据步骤（4）的质谱分析结果，对多肽功能进行生物信息学预测，筛选得到具备抗氧化活性的大西洋鲑肽。

13、本发明还提供如上所述的筛选方法在筛选与各种磷脂或脂肪酸特异性结合的蛋白质或多肽中的应用。

14、本发明还提供如上所述的具备抗氧化活性的大西洋鲑肽在制备抗氧化制剂或细胞保护制剂中的应用，所述制剂包括保健食品、化妆品、功能性食品添加剂。

15、优选的，所述具备抗氧化活性的大西洋鲑肽作为活性成分单独使用或与其他抗氧化活性物质复配使用。

16、本发明还提供如上所述的核酸在制备抗氧化制剂或细胞保护制剂中的应用，所述制剂包括保健食品、化妆品、功能性食品添加剂。

17、优选的，所述核酸作为活性成分单独使用或与其他抗氧化活性物质复配使用。

18、本发明的设计原理：针对现有抗氧化技术的短板，结合前期对多不饱和脂肪酸的研究基础，本发明以富含 omega-3 的大西洋鲑肌肉为靶标，挖掘天然抗氧化活性物质，通过“亲和纯化+无偏倚蛋白质组学”靶向筛选策略，最终锁定八条结构明确的大西洋鲑源肽序列，针对性验证其抗氧化特性，同步解析肽与dha的分子互作机制，为其在抗氧化制剂、细胞保护产品等多场景应用提供理论支撑。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、（1）本发明提供的八条来源于大西洋鲑、兼具高效抗氧化、线粒体保护的特异性多肽序列，结构明确、活性可量化，其中序列如seq id no.2、4、8所示的多肽经分子对接验证可与dha特异性结合，结合自由能≤-6.7 kcal/mol，可增强细胞保护作用，具备脂质稳定化的潜在价值，填补了该领域的肽序列空白。

21、（2）本发明的抗氧化活性肽安全性高、水溶性好、稳定性强，可实现自由基清除与细胞保护双重功能，同时基于明确的分子互作机制，可拓展应用于 dha 稳定化，突破传统抗氧化剂功能单一的局限，应用场景广泛。

22、（3）本发明结合亲和捕获的靶向性与蛋白质组学的高通量优势，可高效富集与不饱和脂肪酸链结合的肽段，建立靶向大西洋鲑源抗氧化肽专属筛选方法，能精准筛选出无毒性、生物活性高、抗氧化性能优异的肽序列，为同类活性肽的筛选提供了新的技术思路。

23、（4）本发明的抗氧化活性肽适用于生物医药、功能制剂、细胞培养、脂质稳定化等多领域应用，为相关产品的开发提供了全新的活性成分。

24、（5）本发明通过分子对接，解析了肽与 dha 的相互作用机制，为该肽的后续序列改造、活性优化及应用拓展提供了可能的理论支撑。

1.具备抗氧化活性的大西洋鲑肽，其特征在于，所述大西洋鲑肽的氨基酸序列选自seqid no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.6或seq id no.7所示多肽中的一种或多种组合。

2.编码如权利要求1所述的大西洋鲑肽的核酸。

3.含如权利要求2所述的核酸的表达载体。

4.含如权利要求3所述的表达载体的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系。

5.如权利要求1所述的具备抗氧化活性的大西洋鲑肽的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的筛选方法在筛选与各种磷脂或脂肪酸特异性结合的蛋白质或多肽中的应用。

7.如权利要求1所述的具备抗氧化活性的大西洋鲑肽在制备抗氧化制剂或细胞保护制剂中的应用，其特征在于，所述制剂包括保健食品、化妆品、功能性食品添加剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述具备抗氧化活性的大西洋鲑肽作为活性成分单独使用或与其他抗氧化活性物质复配使用。

9.如权利要求2所述的核酸在制备抗氧化制剂或细胞保护制剂中的应用，其特征在于，所述制剂包括保健食品、化妆品、功能性食品添加剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述核酸作为活性成分单独使用或与其他抗氧化活性物质复配使用。