对C14脂肪酸酯高选择性的CALA突变体及其应用

本发明属于基因工程，涉及对c14脂肪酸酯高选择性的cala突变体及其应用。

背景技术：

1、脂肪酶（ec 3.1.1.3）是一类能够催化油脂水解、酯化及酯交换反应的生物催化剂，因其反应条件温和、催化效率高，已被广泛应用于油脂精深加工及功能性脂质制备领域。南极假丝酵母脂肪酶a（cala）因具有较好的热稳定性和有机溶剂耐受性，成为该领域的研究热点之一。cala的底物选择性由其“酰基结合隧道”空间结构决定，该酶对中链脂肪酸酯（碳链长度在c6至c12范围内）具有较高活性，并可催化c14及以上长链脂肪酸酯，但其对c14与c16、c18等长链底物的区分能力有限，底物选择性不足以实现特定长链脂肪酸组分的定向富集。

2、随着油脂加工产业向精细化、功能化方向发展，市场对富含特定脂肪酸组分的功能性结构化脂质的需求日益增长。其中，肉豆蔻酸（c14）作为长链饱和脂肪酸，在婴幼儿辅食油脂、保健食用油及药用脂质等领域具有重要应用价值。为实现c14组分的高效富集，需要开发能够有效区分c14与c16、c18等长链脂肪酸酯，并优先催化c14脂肪酸酯参与反应的脂肪酶，以提高目标产物的纯度和营养价值。

3、然而，野生型cala对c14、c16、c18等长链底物的选择性差异较小，难以满足c14定向富集的精细化加工需求。因此，开发一种对c14脂肪酸酯高选择性的cala突变体，对高品质功能性油脂的绿色制备具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种对c14脂肪酸酯高选择性的cala突变体及其应用。本发明将野生型cala的第435位苯丙氨酸突变为甘氨酸得到该cala突变体，其氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:3所示。本发明cala突变体在保留较高催化活性的同时，对底物对硝基苯酚肉豆蔻酸酯（pnp-c14）的催化效率较野生型显著提升，其活性为野生型的2.0倍，该cala突变体对c14脂肪酸酯的底物识别偏好明显增强。本发明为高品质功能性油脂的绿色制备提供一种高选择性的生物催化酶，具有良好的应用前景。

2、一方面，本发明提供一种对c14脂肪酸酯高选择性的cala突变体，所述cala突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。

3、具体地，本发明通过试验发现，野生型cala对pnp-c16的活性最高，达379.44±14.93 u/ml，其次为pnp-c14，活性为340.13±6.08 u/ml。与之相比，所有突变体均在pnp-c14上达到最高催化活性，最适底物链长转变为c14。进一步比较各突变体在同一底物上的活性，结果表明突变体v4的活性显著高于其余突变体，突变体v4的活性为691.84±8.22 u/mg，约为野生型的2.0倍。

4、具体地，本发明通过酶动力学实验发现，野生型cala偏好pnp-c16，其kcat为40.4±3.4 min-1；而所有突变体均对pnp-c14表现出增强的催化活性。其中，突变体v4的kcat最高（63.6±7.6 min-1），且突变体v4对pnp-c14的催化效率（kcat/km）约为野生型的2.9倍，二者分别为10.42 mm-1·min-1和3.60 mm-1·min-1。

5、另一方面，本发明请求保护编码上述cala突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。

6、另一方面，本发明请求保护一种重组质粒，携带上述编码cala突变体的基因。

7、另一方面，本发明请求保护一种宿主细胞，携带上述编码cala突变体的基因或上述重组质粒。

8、另一方面，本发明请求保护上述cala突变体的制备方法，将野生型cala的第435位苯丙氨酸突变为甘氨酸得到所述cala突变体。

9、所述野生型cala的氨基酸序列如seq id no:1所示。

10、另一方面，本发明请求保护上述cala突变体或编码cala突变体的基因或重组质粒或宿主细胞在油脂加工、结构化脂质制备中的应用。

11、进一步地，所述cala突变体对c14脂肪酸酯具有底物选择性，在催化甘油三酯的合成、重构或水解反应时优先作用于c14脂肪酸残基。

12、还有，本发明请求保护一种c14脂肪酸酰基转移方法，由上述cala突变体催化c14脂肪酸酰基供体与甘油受体发生酯化反应和/或酯交换反应，将c14脂肪酸酰基供体上的c14酰基转移至甘油受体上；

13、所述c14脂肪酸酰基供体为c14脂肪酸和/或c14脂肪酸酯。

14、与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：

15、本发明野生型cala的第435位苯丙氨酸突变为甘氨酸得到该cala突变体，其氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:3所示。本发明cala突变体在保留较高催化活性的同时，对底物对硝基苯酚肉豆蔻酸酯（pnp-c14）的催化效率较野生型显著提升。本发明通过试验发现，野生型cala对pnp-c16的活性最高，达379.44±14.93 u/ml，其次为pnp-c14，活性为340.13±6.08 u/ml。与之相比，所有突变体均在pnp-c14上达到最高催化活性，最适底物链长转变为c14。进一步比较各突变体在同一底物上的活性，结果表明突变体v4的活性显著高于其余突变体，突变体v4的活性为691.84±8.22 u/mg，约为野生型的2.0倍，表明该cala突变体对c14脂肪酸酯的底物识别偏好明显增强。本发明为高品质功能性油脂的绿色制备提供一种高选择性的生物催化酶，具有良好的应用前景。

1.一种对c14脂肪酸酯高选择性的cala突变体，其特征在于，所述cala突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。

2.编码权利要求1所述cala突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seqid no:3所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，携带权利要求2所述的基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，携带权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组质粒。

5.权利要求1所述的cala突变体的制备方法，其特征在于，将野生型cala的第435位苯丙氨酸突变为甘氨酸得到所述cala突变体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述野生型cala的氨基酸序列如seqid no:1所示。

7.权利要求1所述的cala突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组质粒或权利要求4所述的宿主细胞在油脂加工、结构化脂质制备中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述cala突变体对c14脂肪酸酯具有底物选择性，在催化甘油三酯的合成、重构或水解反应时优先作用于c14脂肪酸残基。

9.一种c14脂肪酸酰基转移方法，其特征在于，由权利要求1所述的cala突变体催化c14脂肪酸酰基供体与甘油受体发生酯化反应和/或酯交换反应，将c14脂肪酸酰基供体上的c14酰基转移至甘油受体上；