一种牛初始样胚胎干细胞培养基及其建系培养方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种牛初始样胚胎干细胞培养基及其建系培养方法和应用。

背景技术：

1、多能性干细胞（pluripotent stem cells,pscs）具备无限自我更新能力、完整的三胚层分化潜能，且易于开展基因工程操作，为农业动物的遗传改良和种质资源保护开辟了变革性技术途径。在牛等大型农业哺乳动物中，多能性干细胞的应用价值主要体现在基于干细胞的遗传育种，以及构建携带复杂多重基因修饰的动物个体，是推动畜禽育种技术升级、种质资源创新的核心工具之一。

2、目前已有研究成功建立了源自奶牛胚胎的多能性干细胞系，但牛胚胎干细胞的产业化应用始终受限于该领域的根本瓶颈：缺乏化学成分明确的标准化培养体系。现有的牛多能性干细胞培养体系普遍依赖成分复杂的培养基或添加组分，例如商品化复合培养基mtesr-plus、血清替代物ksr等。此类成分不明确的添加物，使得研究人员长期无法清晰界定维持牛干细胞多能性所必需的关键信号通路；同时，化学成分模糊的培养条件不仅导致实验结果难以重复，也严重阻碍了牛胚胎干细胞的稳定建系、克隆纯化以及长期自我更新能力的维持，是制约该领域技术发展的核心根源。

3、根据细胞多能性状态的差异，多能性干细胞可分为初始态（naïve）、形成态（formative）与激发态（primed）三类。现有研究已建立的牛多能性干细胞（bovinepluripotent stem cells,bpscs）多具有形成态多能性特征，但其培养体系仍存在多方面的技术缺陷：其一，不同研究采用的多能性维持小分子与生长因子组合各不相同，行业内缺乏统一、化学定义明确的标准化培养配方，不同实验室的培养体系难以复用和横向对比；其二，现有体系的基础培养基多采用添加ksr的n2b27体系，该体系本身成分复杂，包含白蛋白、转铁蛋白、胰岛素及多种未知血清因子，其产生的补偿效应会掩盖小分子或生长因子组合的真实功能缺陷，导致研究人员难以精准识别维持牛干细胞多能性的必需信号通路。

4、类似的技术局限在近缘物种的研究中同样存在：例如在绵羊胚胎干细胞的相关研究中，仅添加wnt通路抑制剂即可在mtesr-plus培养基中维持细胞多能性，但由于mtesr-plus本身为成分复杂的商品化混合物，无法明确其中究竟哪些组分对干细胞多能性维持是必需的，也无法排除培养基中其他组分的干扰作用。此外，部分研究采用同一种培养条件从牛胚胎多个发育阶段（e5-e14）建立干细胞，忽视了不同发育时期细胞命运调控通路存在的本质差异，无法实现针对特定发育阶段细胞的精准培养与状态调控。

5、综上，现有的牛多能性干细胞培养体系因过度依赖成分复杂的未定义添加物，本质上掩盖了多能性维持必需的信号组件的识别，无法构建出稳定、可控且化学成分完全明确的培养体系，也难以实现牛初始态多能性干细胞的稳定建立与长期维持，制约了牛多能性干细胞在遗传育种、基因编辑、种质资源保存等领域的深入应用。因此，开发一种化学成分明确、可稳定维持牛初始样胚胎干细胞多能性的培养基及配套建系培养方法，是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种牛初始样胚胎干细胞培养基及其建系培养方法和应用，构建了适配牛胚胎干细胞初始样状态维持的精准调控体系，为系统解析牛多能性干细胞维持的分子机制提供了清晰可靠的研究工具。

2、本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种牛初始样胚胎干细胞培养基，以essential 8培养基为基础培养基，添加小分子抑制剂组合与多能性维持细胞因子，不含血清、血清替代物、n2添加剂、b27添加剂；所述小分子抑制剂组合由chir99021、wh-4-023、iwr-1及sb590885组成；所述多能性维持细胞因子包括human lif、fgf2和激活素a。

4、进一步的，还添加有β-巯基乙醇、牛血清白蛋白、谷胱甘肽、丙酮酸钠、非必需氨基酸、its-x、维生素c；各组分的终浓度或含量为：β-巯基乙醇50μm，牛血清白蛋白0.2%，激活素a 20ng/ml，谷胱甘肽3μg/ml，丙酮酸钠1%，非必需氨基酸1%，its-x 0.4%，chir99021 2μm，wh-4-023 0.3μm，iwr-1 2.5μm，维生素c 50μg/ml，sb590885 0.5μm，human lif 2ng/ml，fgf2 20ng/ml。

5、本发明还提供了一种牛初始样胚胎干细胞的建系培养方法，包括以下步骤：

6、（1）取体外受精后第6～7天的牛囊胚，去除透明带后接种并固定于铺有饲养层细胞的培养板中，使用所述的培养基进行培养，每日更换培养基，培养至内细胞团增殖形成原代细胞集落；

7、（2）将原代细胞集落消化为单细胞后传代扩增，获得牛初始样胚胎干细胞系。

8、进一步的，所述饲养层细胞为经钴源照射灭活的牛胎儿成纤维细胞，其制备方法为：解冻牛胎儿成纤维细胞，待细胞处于对数生长期时按1:10比例传代扩繁，扩繁至所需细胞量后胰酶消化3~5min，用牛成纤维细胞培养基中和后200g离心5min，重悬为细胞悬液后以40gy剂量进行钴源照射；照射后再次离心并重悬于细胞冻存液中冻存；所述牛成纤维细胞培养基为添加10%胎牛血清、1×丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、1×青链霉素的dmem培养基。

9、进一步的，获得牛初始样胚胎干细胞系后，后续传代采用基质胶包被的培养板进行无饲养层培养；传代时使用tryple消化细胞，按1:6的比例每2日传代一次。

10、进一步的，所得牛初始样胚胎干细胞支持单细胞传代，可稳定传代100代以上，且长期传代后保持正常核型。

11、本发明还提供了一种所述的培养基在维持牛胚胎干细胞初始样多能性状态中的应用。

12、进一步的，所述维持牛胚胎干细胞初始样多能性状态包括：使细胞高表达oct4、sox2、nanog、klf2、klf4、tbx3、stat3多能性及初始态相关基因，维持oct4、nanog等多能性基因以及klf2、klf4等初始态标志性基因的功能区低甲基化状态，并激活pi3k-akt、hippo与初始态多能性维持相关的信号通路。

13、进一步的，所得牛初始样胚胎干细胞用于拟胚体形成、体外三胚层分化以及嵌合胚胎构建。

14、进一步的，所述培养基应用于牛早期胚胎发育研究、基因编辑、生物育种、动物克隆及体外定向分化领域。

15、本发明有益效果在于：

16、本发明提供的牛初始样胚胎干细胞培养体系以化学成分完全明确为核心优势，彻底摆脱了现有牛多能性干细胞培养对血清、血清替代物ksr、n2添加剂、b27添加剂以及mtesr-plus等成分复杂的商品化培养基的依赖，全部组分由化学结构清晰的小分子化合物与重组蛋白构成，培养条件精准可控，有效解决了传统体系因成分不明导致的实验结果可重复性差、多能性维持关键信号通路难以识别的行业共性瓶颈。本发明以essential 8为基础培养基，通过引入chir99021、wh-4-023、iwr-1及sb590885组成的4种小分子抑制剂组合，联合lif、fgf2及激活素a等多能性维持细胞因子，协同调控wnt、src、braf、pi3k-akt及hippo等多条与干细胞多能性维持密切相关的信号通路，构建了适配牛胚胎干细胞初始样状态维持的精准调控体系，为系统解析牛多能性干细胞维持的分子机制提供了清晰可靠的研究工具。

17、基于上述培养基建立的建系培养方法，能够从牛体外受精后第6～7天的囊胚中高效分离获得胚胎干细胞，通过物理方式去除透明带、结合饲养层贴壁固定培养的操作，可稳定诱导内细胞团增殖并形成原代干细胞集落；在此基础上，本体系支持细胞从饲养层培养平稳转换为基质胶包被的无饲养层培养模式，无需长期依赖饲养层细胞，大幅简化了培养操作流程，降低了饲养层引入的异源成分与批次差异风险。经长期培养验证，采用本发明体系获得的牛胚胎干细胞呈现稳定的圆顶状克隆形态，支持单细胞消化传代，传代比例可达1:6，每2日即可传代一次，细胞可稳定扩增培养超过100代、连续培养358天仍保持形态稳定，且长期传代后细胞仍维持正常二倍体核型，具备优异的体外长期自我更新能力与遗传稳定性。

18、采用本发明体系获得的牛初始样胚胎干细胞具备完整的多能性特征与发育潜能，细胞在转录水平与蛋白水平均稳定高表达oct4、sox2、nanog等核心多能性因子，同时具备强碱性磷酸酶活性，符合多能性干细胞的典型分子表型。在分化潜能方面，该细胞可通过悬滴培养自发形成球形拟胚体结构，经贴壁分化后可分别向外胚层、中胚层、内胚层细胞分化，稳定表达三胚层特异性标志物，具备完整的三胚层分化潜能。在发育潜能层面，该干细胞可通过显微注射整合进入牛桑葚胚并进一步参与囊胚内细胞团的形成，嵌合位置与内细胞团标志物sox2的表达区域高度吻合，且注射操作不会对胚胎发育速率与囊胚发育率造成显著负面影响，证实其具备良好的胚胎嵌合能力与体内发育潜能。

19、从组学与表观遗传层面来看，本发明培养体系维持的牛胚胎干细胞在转录组特征上与牛早期初始态囊胚高度相似，显著区别于形成态胚胎干细胞；细胞高表达klf2、klf4、spp1、stat3、tbx3、jam2等初始态标志性基因，同时低表达dnmt3b、dnmt3l、zic2、cldn7等形成态标志基因与foxa2、tdg等激发态标志基因，呈现典型的初始样多能性分子特征。信号通路富集分析结果显示，该体系下细胞的hippo、pi3k-akt、ecm等与初始态多能性维持密切相关的信号通路显著激活，与已报道的小鼠、人初始态干细胞的通路特征高度一致。全基因组甲基化分析进一步证实，细胞中oct4、nanog等核心多能性基因的功能调控区域维持低甲基化状态，同时klf2、klf4等初始态关键基因的功能区也处于低甲基化水平，从表观遗传层面验证了本体系能够稳定维持牛胚胎干细胞的初始样多能性状态，明确了初始态维持的表观调控基础。

20、本发明通过构建成分完全明确的培养体系，清晰揭示了维持牛初始样胚胎干细胞自我更新与多能性所需的关键信号调控条件，填补了牛初始态干细胞化学成分明确培养体系的技术空白。该体系稳定性高、可重复性强，不仅为牛早期胚胎发育机制的基础研究提供了可靠的细胞模型，也为牛基因编辑、生物育种、动物克隆、种质资源保存以及体外定向分化等应用研究提供了稳定可控的多能性干细胞技术平台，对推动大型农业哺乳动物干细胞育种、复杂基因修饰动物培育以及畜禽遗传资源保护等领域的发展具有重要的支撑作用。