一种高值发酵液及其制备方法与流程

背景技术：

1、研究者发现母乳的许多有益作用都归功于人乳寡糖(humanmilkoligosaccharides，hmos)。其中，乳糖-n-三糖(lacto-n-triose ii，lntii)、乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)、乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)、2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2'-fl)和3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-fl)等成份是hmos中的主要成分，发挥双歧因子的作用。研究证明，以牛乳或羊乳作为主要原料的婴幼儿配方奶粉中添加hmos，并且喂养婴幼儿，可以在婴幼儿的营养、免疫等方面接近母乳哺育的效果。因此，向婴幼儿奶粉、一些人造奶、乳制品、婴儿食品以及功能保健品或特殊人群食品中添加具有生理功能的hmos，将大大提高相应人群的身体素质，提高人们的生活质量。

2、脂肪酸是人体必需的重要营养素之一，其主要功能包括提供能量、构成细胞膜、参与激素的合成、支持大脑发育及维护心血管健康等。不同类型的脂肪酸(如饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸)对健康的影响差异显著，需通过均衡饮食科学摄入。脂肪酸中的亚油酸(linoleic acid，la)是一种多不饱和脂肪酸，其化学名：顺,顺-9,12-十八碳二烯酸甲酯(简称：c18:2n6c)。其主要存在于橄榄油、坚果、牛油果等天然食物中。人体无法自行合成亚油酸，需从食物中摄取。缺乏时可能出现生长迟缓、免疫力下降、皮肤干燥等问题。

3、当前，la的制备方法，有化学法和生物法。由于化学法存在制备步骤繁琐，制备成本高等问题，近年来，生物法被广泛研究和使用，但由于其生产la的效率较低，限制了la在常规食品添加剂上的规模化应用。

4、综上，构建能够高效率合成人乳寡糖(hmo)和脂肪酸以及亚油酸(la)的细胞工厂，满足人类的健康需求并提供适合工业化应用的工艺至关重要。

技术实现思路

0、 技术实现要素：

1、发明目的：提供一种组合物，其含有对人体有益的人乳寡糖[humanmilkoligosaccharides,hmo(s)]、脂肪酸和酵母细胞。

2、本发明的另一个目的：是提供一种能够促进亚油酸合成的多肽，以提高发酵液中亚油酸的产量。

3、本发明的另一个目的：是提供一种合成人乳寡糖和亚油酸的基因修饰细胞，以提高其合成效率。

4、技术方案：

5、申请人惊奇的发现，在利用酵母基因修饰细胞从头合成人乳寡糖的发酵液中，还存在丰富的脂肪酸，特别是亚油酸(linoleic acid，la)。本技术通过酵母基因修饰细胞的使用，实现了发明目的。

6、本技术的第一个方面，提供了含有至少一种人乳寡糖、脂肪酸和酵母基因修饰细胞的组合物。优选的，所述脂肪酸中含有亚油酸。

7、优选的，所述人乳寡糖，选自如下方案中的一种或多种：

8、(1)乳糖-n-三糖(lacto-n-triose ii,lnt ii，分子式：c20h35no16，cas:75645-27-1)；或

9、(2)乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt，分子式:c26h45no21，cas：14116-68-8)、乳糖-n-三糖；或

10、(3)乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt，分子式:c26h45no21，cas：13007-32-4)、乳糖-n-三糖；或

11、(4)乳糖-n-四糖、乳糖-n-新四糖、乳糖-n-三糖；或

12、(5)2’-岩藻糖乳糖(2'-fucosyllactose，2’-fl，化学式：c18h32o15，cas：41263-94-9)；或

13、(6)3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-fl，化学式：c18h32o15，cas：41312-47-4)，

14、优选的，所述人乳寡糖为如上(5)所述2’-岩藻糖基乳糖时，组合物中还含有二岩藻糖基乳糖(difucosyllactose，dfl，分子式：c24h42o19，cas：34852-43-2)。

15、优选的，所述酵母基因修饰细胞含有delta-12去饱和酶的核酸序列。

16、优选的，所述酵母基因修饰细胞为具有合成人乳寡糖和脂肪酸活性的基因修饰细胞，其包括但不限于克鲁维酵母属(kluyveromyces sp.)、毕赤酵母属(pichia sp.)、酵母属(saccharomyces sp)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces sp.)、红冬孢酵母属(rhodosporidiumsp.)和耶氏酵母属(yarrowia sp.)等的基因修饰细胞。

17、优选的，所述基因修饰细胞，包括但不限于多布克鲁维酵母(kluyveromycesdobzhanskii)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(kluyveromyces thermotolerans)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、亚罗克鲁维酵母(kluyveromycesyarrowii)、毕赤酵母(pichiapastoris)、裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)和圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)等基因修饰细胞。

18、在一个实施例中，所述人乳寡糖为乳糖-n-三糖，所述酵母基因修饰细胞为具有合成乳糖-n-三糖活性和脂肪酸活性的基因修饰细胞。优选的，所述酵母基因修饰细胞含有具有合成乳糖-n-三糖活性的乙酰氨基葡萄糖基转移酶(β-n-acetylglucosaminyltransferase)和delta-12去饱和酶的异源核酸序列。所述乙酰氨基葡萄糖基转移酶其来源包括但不限于中国专利202211453172.5(发明名称：重组酵母菌及其应用)所述脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidis)、或幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)、或肠道沙门氏菌(salmonella enterical)的乙酰氨基葡萄糖基转移酶。

19、在一个实施例中，所述人乳寡糖为乳糖-n-四糖，所述酵母基因修饰细胞为具有合成乳糖-n-四糖活性和脂肪酸活性的基因修饰细胞。优选的，所述酵母基因修饰细胞含有具有合成lnt活性的半乳糖基转移酶和delta-12去饱和酶的核酸序列。优选的，所述酵母基因修饰细胞包括但不限于中国专利202510546686.2(发明名称：合成四糖的多肽及含有所述多肽基因的基因修饰细胞)所述酵母细胞或其基因修饰细胞，优选解脂耶氏酵母基因修饰细胞yl-b0至yl-b9或yl-b0-j至yl-b9-j中的任一种；如导入zl202211449962.6(发明名称：合成寡糖的成熟多肽序列及应用)专利所述的任一种具有合成lnt活性的成熟多肽的核酸序列。

20、在一个实施例中，所述人乳寡糖为乳糖-n-新四糖，所述酵母基因修饰细胞为具有合成乳糖-n-新四糖活性和脂肪酸活性的基因修饰细胞。优选的，所述酵母基因修饰细胞含有具有合成lnnt活性的半乳糖基转移酶和delta-12去饱和酶的核酸序列，其包括但不限于中国专利202510546666.5(发明名称：合成新四糖的多肽及含有所述多肽基因的基因修饰细胞)所述酵母细胞或其基因修饰细胞，优选解脂耶氏酵母yl-a0至yl-a9或yl-a0-j至yl-a9-j中的任一种。

21、在一个实施例中，所述人乳寡糖为乳糖-n-四糖和乳糖-n-新四糖，所述酵母基因修饰细胞为具有合成乳糖-n-四糖和乳糖-n-新四糖活性和脂肪酸活性的基因修饰细胞。优选的，所述酵母基因修饰细胞含有具有同时合成lnt和lnnt活性的半乳糖基转移酶的核酸序列和delta-12去饱和酶的核酸序列，所述酵母基因修饰细胞包括但不限于如中国专利

22、202510533839.x(发明名称：合成hm0s的多肽及含有所述多肽基因的基因修饰细胞)所述酵母细胞或其基因修饰细胞，如解脂耶氏酵母yl-m0至yl-m8或yl-m0-j至yl-m8-j中的任一种，或含有如中国专利zl202211473306x(发明名称：合成hmos的成熟多肽序列及应用)或zl202211451076.7(发明名称：一种合成寡糖的成熟多肽)所述具有合成lnt和lnnt活性的任一种成熟多肽的异源核酸序列的酵母基因修饰细胞。

23、在一个实施例中，所述人乳寡糖为2’-岩藻糖基乳糖，所述酵母基因修饰细胞为具有合成2’-岩藻糖基乳糖活性和脂肪酸活性的酵母基因修饰细胞。优选的，所述酵母基因修饰细胞含有gdp-岩藻糖合成酶、gdp-甘露糖-脱水酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽(具有α-1,2-岩藻糖基转移活性)和delta-12去饱和酶的核酸序列。当使用不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽时，如幽门螺杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽，产物中还含有二岩藻糖基乳糖。所述gdp-岩藻糖合成酶包括但不限于如中国专利申请202311635360.4(发明名称：gdp-岩藻糖合成酶多肽及其应用)所述具有gdp-岩藻糖合成酶活性的多肽，所述gdp-甘露糖脱水酶包括但不限于如中国专利申请202311640201.3(发明名称：一种gdp-甘露糖脱水酶多肽及其应用)所述具有gdp-甘露糖-4,6-脱水酶活性的多肽，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶包括但不限于202311372479.7(发明名称：一种岩藻糖基转移酶多肽及其应用)所述具有合成2’-岩藻糖基乳糖活性的α-1,2-岩藻糖基转移酶多肽。

24、在一个实施例中，所述人乳寡糖为3-岩藻糖基乳糖，所述酵母基因修饰细胞为具有合成3-岩藻糖基乳糖活性和脂肪酸活性的酵母基因修饰细胞。优选的，所述酵母含有gdp-岩藻糖合成酶、gdp-甘露糖-4,6-脱水酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶多肽的异源核酸序列和delta-12去饱和酶的核酸序列。所述gdp-岩藻糖合成酶包括但不限于如中国专利申请202311635360.4(发明名称：gdp-岩藻糖合成酶多肽及其应用)所述具有gdp-岩藻糖合成酶活性的多肽，所述gdp-甘露糖脱水酶包括但不限于如中国专利申请202311640201.3(发明名称：一种gdp-甘露糖脱水酶多肽及其应用)所述具有gdp-甘露糖-4,6-脱水酶活性的多肽，所述α-1,3-岩藻糖基转移酶包括但不限于202410206745.7(发明名称：岩藻糖基转移酶多肽及其应用)所述具有合成3-岩藻糖基乳糖活性的α-1,3-岩藻糖基转移酶多肽。

25、优选的，合成如上所述含有至少一种人乳寡糖、脂肪酸和酵母基因修饰细胞组合物的酵母基因修饰细胞含有delta-12去饱和酶的核酸序列，优选解脂耶氏酵母基因修饰细胞，或导入delta-12去饱和酶核酸序列的其他酵母基因修饰细胞。

26、优选的，所述酵母基因修饰细胞为具有合成人乳寡糖和脂肪酸活性的基因修饰细胞，其包括但不限于克鲁维酵母属(kluyveromyces sp.)、毕赤酵母属(pichia sp.)、酵母属(saccharomyces sp)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces sp.)、红冬孢酵母属(rhodosporidiumsp.)和耶氏酵母属(yarrowia sp.)等的基因修饰细胞，

27、优选的，所述基因修饰细胞，包括但不限于多布克鲁维酵母(kluyveromycesdobzhanskii)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(kluyveromyces thermotolerans)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、亚罗克鲁维酵母(kluyveromycesyarrowii)、毕赤酵母(pichiapastoris)、裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)和圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)等基因修饰细胞。

28、优选的，所述所述酵母基因修饰细胞含有合成目标人乳寡糖和脂肪酸的核酸序列。

29、优选的，所述酵母基因修饰细胞选自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)，其含有乳糖转运蛋白(lac12)的异源核酸序列。

30、所述乳糖转运蛋白，负责将乳糖由胞外转移至胞内。在一些实施方案中，所述乳糖转运蛋白的来源包括但不限于粗糙脉孢菌(neurospora crassa)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、瓶霉(phialophora attae)、苜蓿根瘤菌(rhizobium meliloti)、运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)、或大肠杆菌(escherichia coli)等。

31、本技术的第二个方面，提供了一种新型的delta-12去饱和酶，其为氨基酸序列如seq id no:1所示多肽的衍生肽。seq id no:1所示多肽的微生物来源为yarrowialipolytica atcc 20460，genbank accession no.cr382128。

32、优选的，所述衍生肽，其氨基酸序列与seq id no:1具有至少70％以上想相同性，且具有合成脂肪酸和亚油酸活性。

33、优选的，所述seq id no:1所示多肽的衍生肽选自如下突变方式中的任一种：

34、(1)氨基酸序列如seq id no:1所示多肽的第4-5位氨基酸之间插入salpkqnpalrrtvt，得多肽c1，

35、(2)多肽c1的第19-20位氨基酸之间插入dsprh，得多肽c2，

36、(3)多肽c1的第32-33位氨基酸之间插入diakpkseygv3，得多肽c3，

37、(4)多肽c3的第90-91位氨基酸之间插入pe，得多肽c4，

38、(5)多肽c4的第186-187位氨基之间插入km，得多肽c5，

39、(6)多肽c5的第231-232位氨基酸之间插入egrgkgkhnglg，得多肽c6，

40、(7)多肽c6的第378-379位氨基酸之间插入gprg，得多肽c7，

41、(8)多肽c7的第394-395位氨基酸之间插入psa，得多肽c8，

42、(9)多肽c8的第378-379位氨基酸之间插入gagk，得多肽c9。

43、本技术的第三个方面，提供了一种多核苷酸，其编码如上所述衍生多肽c1-c9中的任一种。

44、编码衍生多肽c1-c9的多核苷酸可以使用本领域中公知的重组dna技术来制备。这些方法包括但不限于克隆、重组、体外合成、体外扩增等方法。

45、本技术的第四个方面，提供了一种核酸构建体，其包含如上所述多核苷酸。

46、所述核酸构建体，优选的，还含有与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个调控序列，所述调控序列可指导多肽在适当的表达宿主中生产。

47、本技术的第五个方面，提供了一种表达载体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，或者包含如上述第四方面所述的核酸构建体。

48、本技术的第六个方面，提供了一种转化的宿主细胞，其转化了权利要求1所述的delta-12去饱和酶的核酸序列。

49、优选的，所述转化的宿主细胞，其含有第三方面所述多核苷酸、或第四方面所述核酸构建体、或第五方面所述表达载体。

50、优选的，所述转化的宿主细胞，包括但不限于细菌、酵母、霉菌等天然菌株或基因修饰菌株；

51、进一步优选的，所述转化的宿主细胞，包括但不限于埃希氏菌属(escherichiasp.)、芽孢杆菌属(bacillus sp.)、克鲁维酵母属(kluyveromyces sp.)、红冬孢酵母属(rhodosporidiumsp.)、耶氏酵母属(yarrowia sp.)等菌株，

52、进一步优选的，所述转化的宿主细胞，包括但不限于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)和圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)等菌株，

53、进一步优选的，所述转化的宿主细胞为大肠杆菌基因工程菌e.coli bl21(de3)。

54、本技术的第七个方面，提供了所述第二方面所述衍生多肽的表达方法，其包括：

55、(1)在适合表达所述衍生多肽的条件下，培养所述转化的宿主细胞；所述转化的宿主细胞如上述第六方面所述；和

56、(2)回收所述多肽。

57、在具体实施方案中，所述步骤(1)包括：首先将包含编码如上述第二方面所述衍生多肽的核酸构建体、或重组表达载体导入宿主细胞中，构建表达所述衍生多肽的工程化宿主细胞；然后，培养所述工程化宿主细胞，并诱导其表达所述衍生多肽。

58、在具体实施方案中，所述步骤(2)包括将所述衍生多肽从培养物中分离、纯化的步骤。

59、可以使用本领域已知的方法，在适合于产生多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许衍生多肽表达和/或分离的条件下，在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域已知的程序，在适合的培养基中发生，所述培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可以通过商业渠道购买，或根据公开的组成制备。

60、可以使用本领域已知的方法，从培养物中回收所述多肽。例如，可以通过多种常规程序从营养培养基中回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

61、此外，可以通过本领域已知的多种程序来纯化衍生多肽，以获得基本上纯的衍生多肽，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、凝胶过滤色谱法)、电泳程序法(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page法、盐析等或其组合；进一步优选地，可通过ni柱亲和层析法进行纯化。

62、本技术的第八个方面，提供了一种酵母基因修饰细胞，所述酵母基因修饰细胞，包括与第二方面所述衍生多肽c1-c9具有至少70％及以上相同氨基酸序列的多肽的核酸序列，其具有较高的合成亚油酸的活性。

63、优选的，所述酵母基因修饰细胞，含有第二方面所述衍生多肽c1-c9中的任一种的异源核酸序列。

64、优选的，所述酵母基因修饰细胞为具有合成人乳寡糖和脂肪酸活性的基因修饰细胞，其包括但不限于克鲁维酵母属(kluyveromyces sp.)、毕赤酵母属(pichia sp.)、酵母属(saccharomyces sp.)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces sp.)、红冬孢酵母属(rhodosporidiumsp.)和耶氏酵母属(yarrowia sp.)等的基因修饰细胞。

65、优选的，所述基因修饰细胞，包括但不限于多布克鲁维酵母(kluyveromycesdobzhanskii)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(kluyveromyces thermotolerans)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、亚罗克鲁维酵母(kluyveromycesyarrowii)、毕赤酵母(pichiapastoris)、裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)和圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)等，优选解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)基因修饰细胞。

66、优选的，所述所述酵母基因修饰细胞含有合成目标人乳寡糖和脂肪酸的核酸序列。

67、优选的，所述酵母基因修饰细胞选自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)，其含有乳糖转运蛋白(lac12)的异源核酸序列。

68、所述酵母基因修饰细胞的制备方法，包括如下步骤：

69、(1)培养出发菌株。

70、(2)构建表达盒，在出发菌株中导入第二方面所述衍生多肽c1-c9中的任一种的异源核酸序列。

71、(3)检查出发菌株所含有的核酸序列，根据需要导入合成目的人乳寡糖所必须的核酸序列。

72、任选的，(4)构建分子标记表达盒，在出发菌株中导入标记基因。

73、(5)回收所述基因修饰细胞的步骤。

74、本技术的第九个方面，提供了第六方面所述转化的宿主细胞和第八方面所述酵母基因修饰细胞在合成人乳寡糖和脂肪酸方面的应用。优选的，所述脂肪酸中含有亚油酸。

75、在一个实施例中，第一方面所述组合物为酵母基因修饰细胞从头合成人乳寡糖和脂肪酸的发酵液。优选的，所述脂肪酸中含有亚油酸。

76、本技术的第十个方面，提供了一种第一方面所述组合物的制备方法。所述方法包括如下步骤：

77、a.培养能够产生一种或多种人乳寡糖和脂肪酸的酵母细胞，

78、优选的，所述酵母细胞选自如上第六方面所述转化的宿主细胞或第八方面所述具有人乳寡糖和脂肪酸活性的酵母基因修饰细胞，优选解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)基因修饰细胞；

79、优选的，所述一种或多种人乳寡糖如第一方面所述。

80、优选的，所述脂肪酸中含有亚油酸。

81、b.在合适的培养基中培养步骤(a)的酵母细胞以合成所述一种或多种人乳寡糖、脂肪酸以及亚油酸，所述一种或多种人乳寡糖如第一方面所述；以及

82、c.任选地，纯化所述一种或多种人乳寡糖、脂肪酸以及亚油酸。

83、优选的，所述制备方法，培养基中含有葡萄糖和乳糖。

84、优选的，所述制备方法，适宜的发酵温度为15-40℃，溶液ph值在5-9范围。

85、第十一个方面，本技术提供了一种固体组合物，所述固体组合物含有人乳寡糖、脂肪酸和亚油酸。

86、优选的，所述组合物含有至少65％及以上(质量百分比)的人乳寡糖、脂肪酸和亚油酸。

87、所述组合物可以根据本领域已知的方法，从第一方面所述发酵液中回收人乳寡糖、脂肪酸和亚油酸。

88、所述固体组合物的制备方法，含有人乳寡糖、脂肪酸和亚油酸的发酵液可通过常规的方式分离。优选地，含有人乳寡糖、脂肪酸和亚油酸的混合物通过细胞破碎、离心、活性炭脱色、超滤、离子交换树脂或电渗析等常规的纯化方法。

89、人乳寡糖、脂肪酸和亚油酸进一步从反应混合物中分离，利用本领域公知的如层析、蒸发、冻干、结晶、沉淀和/或干燥、喷雾干燥技术进一步纯化步骤。

90、有益效果：

91、本技术提供了含有至少一种人乳寡糖、脂肪酸以及亚油酸和酵母基因修饰细胞的组合物。本技术还提供了酵母基因修饰细胞在合成人乳寡糖、脂肪酸以及亚油酸方面的应用，本技术还提供了能够提高亚油酸合成效率的酵母基因修饰细胞。