一种裂殖壶菌转录因子TF7668及其应用

本发明属于代谢工程，具体涉及一种裂殖壶菌转录因子tf7668及其应用。

背景技术：

1、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，dha)是人体自身不能合成，但对人体健康非常有利的一种必需脂肪酸，近年来一直是科学研究的热点。临床试验表明，dha是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在视网膜中所占比例约为50％。因此，dha对于婴幼儿神经系统和视力发育起到非常重要的作用，同时还具有防止心血管疾病发生和抗炎、抗肿瘤等作用。据报道，荷兰dsm公司每年至少销售2000吨dha，销售总额近3.17亿美元。因此，dha具有非常广阔的应用前景。

2、dha的来源主要是海洋鱼类，但海洋鱼类体内会积累大量重金属和有机污染物，对人体较不健康。近年来，研究者们在寻找可持续、高品质的dha替代来源上已做了许多工作。其中，利用海洋微藻异养发酵生产dha已被视为一个主要的替代方法。裂殖壶菌(schizochytrium)是一种富含dha的微藻种属，也是目前在dha发酵生产中使用最为广泛的藻株。裂殖壶菌在dha生产方面的优势是：生长速度较快，最终生物量较高，dha得率相对较高。国际上报道最高值为培养90-100小时，菌体干重200g/l，dha40-45 g/l。目前国内许多单位筛选获得了优良的裂殖壶菌菌种，完成了高密度发酵及中试扩大试验，推动了整个行业的快速发展。

3、目前，裂殖壶菌发酵生产过程中使用的菌株存在油脂及dha含量偏低的问题，且在发酵过程中菌种的性状容易发生退化。因此，利用有效的技术手段对裂殖壶菌进行改造，获得高产且遗传稳定的优良菌种对促进裂殖壶菌生产dha产业的可持续发展是十分重要的。

4、转录因子(transcription factor，tf)具有多点调控和动态调控的独特优势，可以对目标代谢途径进行全面、高效和特异性的调控，因此是改造微生物代谢途径的有力工具。基于转录因子的工程策略已在代谢工程领域得到广泛应用和发展，包括利用全局转录机械工程、实施基于转录因子的生物传感器、应用法定量感应系统进行动态调控以及构建人工转录因子。在微藻领域，由于基因操作系统相对不成熟，对转录调控机制缺乏了解，基于转录因子的工程策略研究仅限于过表达或敲除单个调控因子，并且集中在莱茵衣藻和微拟球藻两类物种中。

5、转录因子工程可以通过单基因操作同时对多个途径的多个基因实现综合调控，是进一步提升裂殖壶菌脂肪酸合成极具潜力的一种方式。但是目前缺乏在裂殖壶菌中预测其转录调控网络的研究，并且通过实验表征鉴定转录因子及其调控机制的报道也相对较少，因此在裂殖壶菌中发掘脂肪酸合成相关的转录因子并将其应用于提升脂质产量具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种裂殖壶菌转录因子tf7668及其应用。所述tf7668通过促进脂肪酸从头生物合成、增强还原力nadph的生成和促进超长链脂肪酸存储于tag来加速裂殖壶菌油脂积累。通过过表达关键转录因子，调控多种重要代谢途径，快速获得性状优良的裂殖壶菌菌种的方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供一种裂殖壶菌转录因子tf7668，所述转录因子tf7668的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、第二方面，本发明提供了一种编码第一方面所述的转录因子tf7668的基因。

5、其中，所述的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、第三方面，本发明提供了含有第二方面所述基因的表达盒或重组载体。

7、第四方面，本发明提供了包含第三方面所述的表达盒或重组载体的重组菌。

8、其中，所述的重组菌的出发菌为裂殖壶菌(schizochytrium)。优选为裂殖壶菌atcc20888(schizochytrium sp.atcc 20888)。

9、第五方面，本发明提供所述的重组菌的构建方法为：将编码所述的转录因子tf7668的基因的表达盒或重组载体导入出发菌中，即得。

10、优选地，所述重组菌的构建方法为：

11、通过构建转录因子tf7668的表达盒；以裂殖壶菌atcc 20888为出发菌种，将构建完成的转录因子tf7668的表达盒转化进入菌体内，获得重组菌种。

12、优选地，所述转录因子tf7668的表达盒包括tef1启动子、编码第一方面所述的转录因子tf7668的基因序列、cyc1终止子及g418抗性基因表达盒。

13、优选地，所述g418抗性基因表达盒包括：g418抗性基因，并通过重叠延伸pcr在上游连接camv 35s启动子，在下游连接camv poly(a)信号。均由基因合成公司合成，从而获得所述g418抗性基因表达盒。

14、第六方面，本发明提供了第四方面所述的重组菌在发酵生产脂肪酸中的应用。

15、优选地，所述的重组菌在发酵生产dha中的应用。

16、在上述技术方案中，将所述重组菌接种至富集培养基中发酵培养。

17、在上述技术方案中，所述富集培养基为：葡萄糖40g/l，酵母提取物0.8g/l，na2so410g/l，(nh4)2so40.8g/l，kh2po44g/l，kcl 0.2g/l，mgso4·7h2o 4.11g/l，谷氨酸钠20g/l，cacl2·2h2o0.13g/l，feso40.58mg/l，mncl25.2mg/l，znso45.2mg/l，cuso40.8mg/l，niso40.8mg/l，cocl20.066mg/l，维生素b10.152mg/l，维生素b120.24mg/l，泛酸钙0.512mg/l，namoo40.016mg/l。

18、本发明的优点和有益效果为：

19、本发明发明人通过裂殖壶菌atcc 20888内源转录因子dap-seq筛选和qrt-pcr验证得到6个tf7668的潜在靶基因：超长链酰基-coa合成酶(vlacs)、丙二酰辅酶-酰基载体蛋白转酰酶(mat)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)、乙酰-coa乙酰转移酶(acat)、nad激酶(nadk)和3-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶(kas)编码基因。通过分析这些潜在靶基因的生物学功能得出结论：tf7668通过促进脂肪酸从头生物合成、增强还原力nadph的生成和促进超长链脂肪酸存储于tag来加速裂殖壶菌油脂积累。

20、本发明提供了一种通过过表达关键转录因子，调控多种重要代谢途径，快速获得性状优良的裂殖壶菌菌种的方法。通过本发明的方法，获得的裂殖壶菌突变菌种，摇瓶发酵60h时总脂肪酸占细胞干重比例提高34％，dha占细胞干重比例提高31％。

1.一种裂殖壶菌转录因子tf7668，其特征在于，所述转录因子tf7668的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的转录因子tf7668的基因。

3.一种根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如seq idno.2所示。

4.一种含有如权利要求2或3所述基因的表达盒或重组载体。

5.一种包含如权利要求4所述的表达盒或重组载体的重组菌。

6.一种如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌的出发菌为裂殖壶菌(schizochytrium)；优选为裂殖壶菌atcc20888(schizochytrium sp.atcc 20888)。

7.一种如权利要求5或6所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：将编码所述的转录因子tf7668的基因的表达盒或重组载体导入出发菌中，即得。

8.一种如权利要求7所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述重组菌的构建方法为：

9.一种如权利要求8所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述转录因子tf7668的表达盒包括tef1启动子、编码转录因子tf7668的基因序列、cyc1终止子及g418抗性基因表达盒；

10.一种如权利要求5或6所述的重组菌在发酵生产脂肪酸中的应用；