一种在库德里阿兹威毕赤酵母体内构建还原三羧酸循环的方法及应用与流程

本发明属于代谢工程和微生物发酵，具体涉及一种在库德里阿兹威毕赤酵母体内构建还原三羧酸循环（rtca循环）途径的方法，以及利用该方法生产l-苹果酸的应用。

背景技术：

1、还原三羧酸循环（reductive tricarboxylic acid cycle，rtca循环）是三羧酸循环（tca循环）的逆向代谢途径。在经典的tca循环中，乙酰辅酶a与草酰乙酸缩合生成柠檬酸，经过一系列氧化脱羧反应最终生成co2并产生大量还原力（nadh）和能量（atp）；而rtca循环则利用nadh和atp将co2固定，通过逆转tca循环的关键步骤合成c4二羧酸。具体而言，rtca循环由丙酮酸羧化酶（pyc）催化丙酮酸固定co2生成草酰乙酸，再由苹果酸脱氢酶（mdh）将草酰乙酸还原为l-苹果酸，随后l-苹果酸可进一步经其他酶催化生成富马酸或琥珀酸，其中pyc和mdh这两个关键酶的催化效率直接影响rtca循环的整体通量。因此，rtca循环不仅是合成c4二羧酸的理想途径，也是实现co2生物固定的重要策略之一。

2、库德里阿兹威毕赤酵母（

pichia kudriavzevii）是一种非模式酵母菌株，具有极强的耐酸性，其在ph为1.5的环境下仍能正常生长，显示出作为有机酸发酵优良底盘细胞的应用潜力。已有研究报道在库德里阿兹威毕赤酵母体内过表达丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶来构建rtca途径用于c4二羧酸的生产，但现有研究中引入的pyc和mdh仍主要来源于米曲霉（

aspergillus oryzae）或黄曲霉（

aspergillus flavus），酶源选择相对单一，缺乏来源于特殊生态位或具有独特催化特性的酶源。因此，发掘和筛选来源多样化、特别是适用于库德里阿兹威毕赤酵母表达系统的新型高活性pyc和mdh酶源，对于拓展rtca循环的酶工具箱，进而构建高效rtca循环以提高c4二羧酸产量具有重要意义。本发明首次将来源于鲁氏接合酵母（

zygosaccharomyces rouxii）的pyc和来源于稗黑粉菌（

ustilago trichophora）的mdh组合应用于库德里阿兹威毕赤酵母rtca循环的构建，为c4二羧酸的生物合成提供了新的酶源及其组合。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术在库德里阿兹威毕赤酵母中构建还原三羧酸循环（rtca循环）时酶源选择单一、催化效率有待进一步提升的缺陷。为此，本发明提供了一组来源于鲁氏接合酵母的丙酮酸羧化酶（zrpyc）和来源于稗黑粉菌的苹果酸脱氢酶（utmdh），并通过在库德里阿兹威毕赤酵母中共表达上述两种酶以构建高效rtca循环的方法。进一步地，本发明还提供用于上述方法的基因、重组菌株及其在l-苹果酸生产中的应用。

2、本发明从一株耐酸性酵母库德里阿兹威毕赤酵母菌株出发，该菌株购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心（cicc），保藏编号为cicc 33427，通过基因工程改造使其表达zrpyc和utmdh，构建rtca循环途径，用于l-苹果酸的发酵生产。

3、第一方面，本发明提供了一种在库德里阿兹威毕赤酵母体内构建还原三羧酸循环的方法，包括以下步骤：

4、将编码来源于鲁氏接合酵母的丙酮酸羧化酶或其保守性突变体的基因整合到库德里阿兹威毕赤酵母基因组中；

5、将编码来源于稗黑粉菌的苹果酸脱氢酶或其保守性突变体的基因整合到库德里阿兹威毕赤酵母基因组中；

6、使基因在酵母中表达，获得具有还原三羧酸循环途径的重组菌株。

7、进一步地，所述来源于鲁氏接合酵母的丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述来源于稗黑粉菌的苹果酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:2所示。

8、进一步地，所述来源于鲁氏接合酵母的丙酮酸羧化酶的保守性突变体满足以下特征：

9、其氨基酸序列与seq id no:1具有至少99%的序列同一性；

10、其与seq id no:1的氨基酸差异为1～12个氨基酸残基的保守性取代，且所述差异仅发生在非活性中心区域；

11、将编码所述突变体的基因与编码苹果酸脱氢酶seq id no:2或其保守性突变体的基因共同整合到库德里阿兹威毕赤酵母基因组后，所获得的重组菌株的l-苹果酸产量不低于将编码seq id no:1所示酶的基因与编码seq id no:2所示酶的基因共同整合到库德里阿兹威毕赤酵母基因组后所获得的对照菌株的80%。

12、进一步地，所述来源于稗黑粉菌的苹果酸脱氢酶的保守性突变体满足以下特征：

13、其氨基酸序列与seq id no:2具有至少99%的序列同一性；

14、其与seq id no:2的氨基酸差异为1～4个氨基酸残基的保守性取代，且所述差异仅发生在非活性中心区域；

15、将编码所述突变体的基因与编码丙酮酸羧化酶seq id no:1或其保守性突变体的基因共同整合到库德里阿兹威毕赤酵母基因组后，所获得的重组菌株的l-苹果酸产量不低于将编码seq id no:1所示酶的基因与编码seq id no:2所示酶的基因共同整合到库德里阿兹威毕赤酵母基因组后所获得的对照菌株的80%。

16、进一步地，所述编码丙酮酸羧化酶的基因和所述编码苹果酸脱氢酶的基因分别与启动子和终止子可操作连接后导入所述酵母中；所述启动子为组成型强启动子，所述终止子为强终止子。

17、优选地，所述启动子为pgpd启动子，所述终止子为tgal终止子。

18、进一步地，所述编码丙酮酸羧化酶的基因和所述编码苹果酸脱氢酶的基因被整合至所述酵母基因组的非必需基因位点中。

19、优选地，所述编码丙酮酸羧化酶的基因被整合至库德里阿兹威毕赤酵母基因组的

pkpdc1位点中；所述编码苹果酸脱氢酶的基因被整合至库德里阿兹威毕赤酵母基因组的

pkgpd1位点中。

20、第二方面，本发明提供了编码来源于鲁氏接合酵母的丙酮酸羧化酶和来源于稗黑粉菌的苹果酸脱氢酶的基因。

21、进一步地，所述编码丙酮酸羧化酶的基因的核苷酸序列如seq id no:3所示；所述编码苹果酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no:4所示。

22、进一步地，所述seq id no:3和seq id no:4所示的核苷酸序列分别为针对库德里阿兹威毕赤酵母进行密码子优化后的序列。

23、第三方面，本发明提供了一种库德里阿兹威毕赤酵母重组菌株。

24、进一步地，所述重组菌株由第一方面所述的方法构建得到，或包含第二方面所述的基因。

25、进一步地，所述重组菌株的基因组中整合有第二方面所述的编码丙酮酸羧化酶的基因和编码苹果酸脱氢酶的基因。

26、第四方面，本发明提供了第一方面所述的方法、第二方面所述的基因、或第三方面所述的重组菌株在生产l-苹果酸中的应用。

27、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

28、（1）拓宽酶源选择范围。现有技术在库德里阿兹威毕赤酵母中构建rtca循环所使用的丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶大多来源于米曲霉、黄曲霉、米根霉或酿酒酵母等常规菌株，尚未有来源于鲁氏接合酵母的丙酮酸羧化酶和来源于稗黑粉菌的苹果酸脱氢酶在库德里阿兹威毕赤酵母中共表达以构建rtca循环的报道。本发明首次将zrpyc和utmdh组合应用于库德里阿兹威毕赤酵母rtca循环的构建，为c4二羧酸的生物合成提供了新的酶源及其组合。

29、（2）显著提升l-苹果酸产量。将zrpyc和utmdh在库德里阿兹威毕赤酵母中共表达构建rtca循环，所得的重组菌株与使用常规酶源的对照菌株相比，在相同的发酵周期内l-苹果酸产量可提高30%以上，显示出较高的rtca循环整体通量，具有良好的产业化应用前景。