一种高效分泌表达人源乳铁蛋白的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用与流程

本发明属于本发明属于基因工程与微生物发酵，具体涉及一种高效分泌表达人源乳铁蛋白的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、人源乳铁蛋白（human lactoferrin，hltf）是一种分子量约80 kda的铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族，含有703个氨基酸残基，具有广谱抗菌、抗病毒、抗氧化、调节免疫应答及促进铁吸收等多种重要生理功能，在婴幼儿配方食品、营养补充剂、化妆品及医药领域具有广阔的应用前景。

2、目前商品化乳铁蛋白主要依靠牛乳提取，牛乳中乳铁蛋白本底含量仅 0.03-0.49g/l，提取成本高、收率低；并且牛源乳铁蛋白属于异源蛋白，人体使用存在潜在免疫原性风险。因此利用微生物异源表达制备重组人源乳铁蛋白成为重要替代路线。

3、毕赤酵母（pichia pastoris）被美国 fda 认定为 gras 公认安全微生物，兼具原核生物操作简便、生长速度快与真核蛋白折叠、糖基化、分泌加工修饰能力，是重组蛋白生产主流宿主。毕赤酵母分泌表达最常用信号肽为酿酒酵母来源 α-交配因子（α-factor，mfα）pre-pro 前导肽；该信号肽翻译后依次经 kex2 蛋白酶识别 kr 位点切割、ste13 蛋白酶识别 eaea 位点切割，切除信号肽，释放成熟外源蛋白。

4、现有提升 hltf 在毕赤酵母表达的技术手段主要分为三类：

5、第一类为信号肽改造：cn119776401a、cn115960175a、cn120737998a 等专利大多采用整体替换或者大片段改造 α-factor 信号肽，构建杂合信号肽。大幅度改造信号肽会带来蛋白酶加工位点异常、引入非天然氨基酸序列，造成切割不完全、蛋白活性下降风险。

6、第二类为分子伴侣和转运蛋白共表达：通过过表达 kar2、pdi1、ero1、bmh2 等基因改善蛋白折叠与囊泡转运，该类策略主要解决蛋白翻译后折叠瓶颈。

7、第三类为多拷贝整合：利用 g418 梯度筛选获得多拷贝毕赤酵母转化子属于常规操作。但对于分子量较大的 hltf，基因拷贝数与蛋白表达量并非简单正相关；拷贝数过高会造成宿主转录-分泌通路负荷过载，蛋白错误折叠增加，产量反而下降。现有技术缺少针对人源乳铁蛋白系统的最优拷贝数研究。

8、进一步，现有技术中调控元件的导入多基于低拷贝或单拷贝菌株，缺乏在多拷贝乳铁蛋白菌株基础上进一步导入调控元件的系统性研究。

9、因此，本发明旨在解决现有技术上述缺陷，提供一套兼顾信号肽位点优化、拷贝数精细调控、高拷贝缺陷菌株转录强化的完整技术方案，实现人源乳铁蛋白高效分泌。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是针对现有技术中毕赤酵母表达人源乳铁蛋白分泌效率低、表达量不足的技术现状，提供一种高效分泌表达人源乳铁蛋白的重组毕赤酵母菌株及其构建方法，旨在通过eaea切割位点配置优化、多拷贝菌株系统筛选以及调控元件协同强化的集成策略，实现人源乳铁蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种高效分泌表达人源乳铁蛋白的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株的基因组中整合有人源乳铁蛋白表达盒，所述人源乳铁蛋白表达盒包含可操作地相连的启动子、α-交配因子信号肽编码序列及密码子优化的人源乳铁蛋白编码基因，所述密码子优化的人源乳铁蛋白编码基因位于所述α-交配因子信号肽编码序列中ste13蛋白酶识别切割位点编码序列的3'端。

4、作为本发明进一步的优选方案，所述人源乳铁蛋白表达盒在所述基因组中的增加的拷贝数为1～2个。

5、作为本发明进一步的优选方案，所述拷贝数为增加一～两个拷贝，且所述重组毕赤酵母菌株的基因组中还整合有mxr1调控元件表达盒，所述mxr1调控元件表达盒包含组成型gap启动子及mxr1编码基因，所述mxr1编码基因位于所述gap启动子的3'端。

6、作为本发明进一步的优选方案，所述密码子优化的人源乳铁蛋白编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，或为与seq id no.2所示序列具有至少90%序列同一性且编码具有人源乳铁蛋白活性的多肽的核苷酸序列。

7、作为本发明进一步的优选方案，所述mxr1编码基因的氨基酸序列如seq id no.3所示，或为与seq id no.3所示序列具有至少80%序列同一性且具有mxr1转录调控活性的蛋白质的编码序列。

8、作为本发明进一步的优选方案，所述毕赤酵母宿主菌株为毕赤酵母gs115菌株。

9、作为本发明进一步的优选方案，所述启动子为aox1启动子，所述人源乳铁蛋白表达盒还包含aox1终止子。

10、第二方面，本发明提供了一种高效分泌表达人源乳铁蛋白的重组毕赤酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：

11、（1）重组表达质粒的构建：将密码子优化的人源乳铁蛋白编码基因连接于含有α-交配因子信号肽eaea切割位点编码序列的毕赤酵母表达质粒中，所述密码子优化的人源乳铁蛋白编码基因位于所述eaea切割位点编码序列的3'端，获得重组表达质粒ppic9k-eaea-hltf；

12、（2）毕赤酵母转化与阳性筛选：将步骤（1）所得重组表达质粒用sacⅰ进行单酶切线性化后，电转化毕赤酵母gs115感受态细胞，将转化子涂布于md固体培养基上，通过组氨酸营养缺陷互补筛选获得his+阳性转化子；

13、（3）g418梯度筛选多拷贝整合菌株：将步骤（2）所得his⁺阳性转化子涂布于含不同浓度g418的ypd固体培养基上，通过g418浓度梯度筛选，挑取高浓度g418平板上生长的单菌落，获得整合有多拷贝人源乳铁蛋白表达盒的重组毕赤酵母菌株。

14、作为本发明进一步的优选方案，步骤（3）中g418筛选浓度梯度为1.0 mg/ml、3.0mg/ml和4.0 mg/ml，在4.0 mg/ml g418平板上筛选获得高表达人源乳铁蛋白的菌株，命名为gs115-ppic9k-hltf。

15、作为本发明进一步的优选方案，所述方法还包括步骤（4）：将含有单个人源乳铁蛋白表达盒的ppiczhαa-hltf重组质粒用salⅰ酶切线性化后，电转化步骤（3）所得高表达菌株gs115-ppic9k-hltf，通过zeocin抗性筛选，获得增加一拷贝人源乳铁蛋白表达盒的重组毕赤酵母菌株，命名为gs115-ppic9k-hltf-1c。

16、作为本发明进一步的优选方案，所述方法还包括步骤（5）：将含有两个人源乳铁蛋白表达盒的ppiczhαa-hltfⅱ重组质粒用salⅰ酶切线性化后，电转化步骤（3）所得高表达菌株gs115-ppic9k-hltf，通过zeocin抗性筛选，获得增加两拷贝人源乳铁蛋白表达盒的重组毕赤酵母菌株，命名为gs115-ppic9k-hltf-2c。

17、作为本发明进一步的优选方案，所述方法还包括步骤（6）：将pgapzαha-mxr1重组质粒用bsphi酶切线性化后，电转化步骤（5）所得五拷贝菌株gs115-ppic9k-hltf-2c感受态细胞，通过含250 μg/ml潮霉素的ypd平板筛选，获得基因组中还整合有mxr1调控元件表达盒的重组毕赤酵母菌株，命名为gs115-ppic9k-hltf-2c-mxr1。

18、所述ppiczhαa-hltf重组质粒以ppiczhαa为骨架构建，所述ppiczhαa是通过在ppiczαa质粒的pciⅰ酶切位点后插入his4目的基因而获得的重组质粒；所述ppiczhαa-hltfⅱ重组质粒是在ppiczhαa-hltf基础上，将人源乳铁蛋白表达盒（aox1启动子-α-factor-hltf-aox1终止子）再连接至bamhⅰ酶切位点后构建的含有两个hltf表达盒的重组质粒。

19、第三方面，本发明提供了一种重组表达质粒，所述重组表达质粒含有人源乳铁蛋白表达盒，所述人源乳铁蛋白表达盒包含可操作地相连的aox1启动子、α-交配因子信号肽编码序列及密码子优化的人源乳铁蛋白编码基因，所述密码子优化的人源乳铁蛋白编码基因位于所述α-交配因子信号肽编码序列中ste13蛋白酶识别切割位点（eaea）编码序列的3'端。

20、作为本发明进一步的优选方案，所述重组表达质粒以ppic9k为骨架构建，命名为ppic9k-eaea-hltf。

21、作为本发明进一步的优选方案，所述重组表达质粒以ppiczhαa为骨架构建，含有一个人源乳铁蛋白表达盒，命名为ppiczhαa-hltf；或以ppiczhαa为骨架构建、含有两个人源乳铁蛋白表达盒，命名为ppiczhαa-hltfⅱ。

22、第四方面，本发明提供了上述重组毕赤酵母菌株在生产人源乳铁蛋白中的应用。

23、作为本发明进一步的优选方案，利用重组毕赤酵母生产人源乳铁蛋白的方法，包括以下步骤：

24、（1）将上述的重组毕赤酵母菌株接种至ypd培养基中活化，经种子扩培后于bmmy诱导培养基中进行甲醇诱导发酵；

25、（2）每24 h补加甲醇至终浓度0.5%～1.0%（v/v），连续诱导96～120 h；

26、（3）离心收集发酵上清液，获得含人源乳铁蛋白的发酵液。

27、作为本发明进一步的优选方案，步骤（1）中甲醇诱导发酵温度为28～30℃，转速为220～250 rpm。

28、作为本发明进一步的优选方案，所述方法在10 l以上发酵罐中进行，发酵过程包括甘油分批阶段、甘油补料阶段和甲醇诱导阶段；甲醇诱导阶段温度维持在28℃，甲醇浓度维持在0.5%～1.0%（v/v），比生长速率控制在0.015～0.020 h-1，ph维持在5.5。

29、采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

30、1.本发明在不改变α-factor信号肽整体结构的前提下，仅通过将密码子优化的hltf编码基因置于ste13蛋白酶识别切割位点eaea编码序列之后，相较于置于kex2蛋白酶识别切割位点kr之后的对照，hltf的摇瓶分泌表达量明显提升，表明完整的kex2和ste13双重酶切加工流程有助于hltf前体肽的正确切除与成熟蛋白的高效分泌。

31、2.本发明在通过g418梯度筛选精确获得高表达菌株gs115-ppic9k-hltf，其摇瓶表达量约为单拷贝菌株的11倍；在高表达菌株基础上增加一个拷贝后表达量进一步提升；继续增加两个拷贝时表达量反而下降，首次系统揭示了人源乳铁蛋白在毕赤酵母中整合拷贝数存在最优窗口现象，对指导高分子量外源蛋白的重组表达具有重要参考价值。

32、3.本发明在gs115-ppic9k-hltf-2c菌株基础上，通过组成型gap启动子驱动mxr1调控元件持续表达，有效缓解了高拷贝多基因表达负荷对宿主分泌通路造成的瓶颈，最终表达量达较五拷贝菌株提升约58.8%，达到了基因剂量优化和分泌通路强化的双重协同增效效果。

33、4.本发明所得最终优化菌株gs115-ppic9k-hltf-2c-mxr1已验证完成10 l发酵罐放大验证，证明具有良好的规模化生产潜力。