吉玛烯A合酶突变体、高产β-榄香烯的毕赤酵母工程菌及其应用的制作方法

本发明属于基因工程，具体涉及一种吉玛烯a合酶突变体、高产β-榄香烯的毕赤酵母工程菌及其应用。

背景技术：

1、β-榄香烯（β-elemene）是一种从浙江地道药材温郁金中分离提取的倍半萜类天然产物，以其独特的多靶点作用机制、高效低毒和广谱抗肿瘤特性，在临床肿瘤治疗中发挥重要作用。目前，β-榄香烯的生产主要从温郁金中提取，培养周期长，受环境影响大、分离纯化难度大，难以实现高品质的稳定生产。因此，亟需开发稳定且高效的β-榄香烯生产方式。

2、利用大肠杆菌和酵母等微生物底盘生物合成β-榄香烯，已成为当前的研究热点之一。β-榄香烯的生物合成途径已经得到解析，微生物可以通过利用碳源通过甲羟戊酸（mevalonate，mva）途径生成倍半萜前体法尼烯焦磷酸（farnesyl pyrophosphate, fpp），再由吉玛烯a合酶（germacrene a synthase, gas）催化其环化形成吉玛烯a，通过体外高温高压反应转化成β-榄香烯。目前，以大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、多形汉逊酵母等微生物为细胞底盘，β-榄香烯的生物合成研究已取得显著进展。

3、然而，不同宿主对gas的来源及其突变体具有明显的偏好性，其催化效率成为限制β-榄香烯积累的主要因素之一。在解脂耶氏酵母底盘中，通过对向日葵（helianthusannuus l）来源的hagas进行理性设计，使其突变体hagasv436l的催化活性提升2.07倍【liu sc, xu l x, sun y j, et al. 通过模块化工程、途径重构和嵌合吉玛烯a合酶，实现解脂耶氏酵母中β-榄香烯的可持续高效生产（sustainable high-titer production of β-elemene in yarrowia lipolytica via modular engineering, pathway refactoring,and a chimeric germacrene a synthase）[j].chemical engineering journal, 2026,528.】。在大肠杆菌底盘中，通过对莴苣（lactuca sativa）来源的ltc2进行突变改造，其突变体ltc2t392a-t410s生物合成β-榄香烯的水平提升5.44倍【chen r, liu y, chen s, et al.莴苣中吉玛烯a合酶的蛋白质工程及其在大肠杆菌中高产量生产吉玛烯a的应用（proteinengineering of a germacrene a synthase from lactuca sativa and itsapplication in high productivity of germacrene a in escherichia coli）[j].frontiers in plant science, 2022, volume 13 - 2022.】。

4、毕赤酵母（komagataella phaffii）是倍半萜生物合成的优势底盘微生物。现有研究在毕赤酵母中异源表达多变鱼腥藻（anabaena variabilis）来源的gas，并结合代谢工程改造，实现了1.9 g/l的β-榄香烯合成产量【cheng j t, zuo y m, liu g f, et al. 开发巴氏毕赤酵母细胞工厂以高效生产β-榄香烯前体吉玛烯a （development of a pichiapastoris cell factory for efficient production of germacrene a: a precursorof β-elemene）[j]. bioresources and bioprocessing, 2023, 10(1): 38.】，该水平远低于檀香烯等其他倍半萜化合物。由此可见，天然avgas的催化性能有限，严重制约毕赤酵母底盘中β-榄香烯的高效合成，无法满足工业化应用要求。因此，对avgas进行分子改造并筛选优势突变体，是基于毕赤酵母底盘实现β-榄香烯高效适配合成的核心关键。

技术实现思路

1、本发明提供一种吉玛烯a合酶突变体、高产β-榄香烯的毕赤酵母工程菌及其应用。本发明通过对avgas进行基因工程改造，筛选得到催化活性高于原始avgas的突变体，并采用生物安全菌株毕赤酵母进行异源表达，获得一种高产β-榄香烯的毕赤酵母工程菌。

2、本发明所述的吉玛烯a合酶突变体，为seq id no.1所示的多变鱼腥藻来源的吉玛烯a合酶的单点突变体、两点突变体或三点突变体；

3、其中，单点突变体为seq id no.1所示的多变鱼腥藻来源的吉玛烯a合酶中的第227位丙氨酸突变为亮氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.5所示的突变体gas2，或第43位亮氨酸突变为丙氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.13所示的突变体gas6，或第164位缬氨酸突变为甘氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.25所示的突变体gas12，或第44位酪氨酸突变为亮氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.27所示的突变体gas13；

4、两点突变体为seq id no.1所示的多变鱼腥藻来源的吉玛烯a合酶中的第227位丙氨酸突变为亮氨酸、第43位亮氨酸突变为丙氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.29所示的突变体gas2-6，或第227位丙氨酸突变为亮氨酸、第164位缬氨酸突变为甘氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.31所示的突变体gas2-12，或第227位丙氨酸突变为亮氨酸、第44位酪氨酸突变为亮氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.33所示的突变体gas2-13，或第43位亮氨酸突变为丙氨酸、第164位缬氨酸突变为甘氨酸所形成的氨基酸序列如seq idno.35所示的突变体gas6-12，或第43位亮氨酸突变为丙氨酸、第44位酪氨酸突变为亮氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.37所示的突变体gas6-13，或第164位缬氨酸突变为甘氨酸、第44位酪氨酸突变为亮氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.39所示的突变体gas12-13；

5、三点突变体为seq id no.1所示的多变鱼腥藻来源的吉玛烯a合酶中的第227位丙氨酸突变为亮氨酸、第43位亮氨酸突变为丙氨酸、第44位酪氨酸突变为亮氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.43所示的突变体gas2-6-13，或第227位丙氨酸突变为亮氨酸、第164位缬氨酸突变为甘氨酸、第44位酪氨酸突变为亮氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.45所示的突变体gas2-12-13，或第164位缬氨酸突变为甘氨酸、第44位酪氨酸突变为亮氨酸、第163位天冬酰胺突变为丙氨酸所形成的氨基酸序列如seq id no.47所示的突变体gas12-13-14。

6、本发明提供编码上述吉玛烯a合酶突变体的基因。

7、优选地，突变体gas2的编码基因如seq id no.6所示，突变体gas6的编码基因如seq id no.14所示，突变体gas12的编码基因如seq id no.26所示，突变体gas13的编码基因如seq id no.28所示，突变体gas2-6的编码基因如seq id no.30所示，突变体gas2-12的编码基因如seq id no.32所示，突变体gas2-13的编码基因如seq id no.34所示，突变体gas6-12的编码基因如seq id no.36所示，突变体gas6-13的编码基因如seq id no.38所示，突变体gas12-13的编码基因如seq id no.40所示，突变体gas2-6-13的编码基因如seqid no.44所示，突变体gas2-12-13的编码基因如seq id no.46所示，突变体gas12-13-14的编码基因如seq id no.48所示。

8、本发明提供一种重组表达载体，其包含上述编码吉玛烯a合酶突变体的基因。

9、在本发明具体实施方式中，以重组表达载体int1-tef1p-gas-aox1t-donor为重组表达载体代表例，其为含有上述编码吉玛烯a合酶突变体的基因以及tef1启动子和aox1终止子的质粒载体int1-tef1p-aox1t-donor。

10、本发明还提供上述重组表达载体的构建方法，具体步骤如下：

11、分别扩增上述编码吉玛烯a合酶突变体的基因片段和载体骨架片段，然后将编码吉玛烯a合酶突变体的基因片段和载体骨架片段进行组装，转化大肠杆菌从而获得重组表达载体。

12、进一步地，上述重组表达载体int1-tef1p-gas-aox1t-donor的构建方法，具体步骤如下：

13、分别扩增上述编码吉玛烯a合酶突变体的基因片段和载体骨架片段int1-tef1p-aox1t，然后利用无缝克隆方法将吉玛烯a合酶突变体的基因片段和载体骨架片段int1-tef1p-aox1t进行组装，转化大肠杆菌dh5α菌株从而获得重组表达载体int1-tef1p-gas-aox1t-donor。

14、本发明提供一种高产β-榄香烯的毕赤酵母工程菌，其基因组中整合了上述编码吉玛烯a合酶突变体的基因。

15、本发明还提供上述高产β-榄香烯的毕赤酵母工程菌的构建方法，具体步骤如下：

16、将上述重组表达载体通过pcr扩增带有同源臂的含吉玛烯a合酶突变体的表达盒dna片段，与对应向导rna 质粒同时电转导入毕赤酵母gs115-cas9菌株中，获得高产β-榄香烯的毕赤酵母工程菌。

17、本发明提供上述毕赤酵母工程菌在发酵生产β-榄香烯中的应用。

18、进一步地，上述应用的具体方法如下：

19、将毕赤酵母工程菌种子液接种到ypd培养基中，发酵培养24~36h后加入体积为发酵液体积的1/4~1/3的正十二烷进行原位萃取，继续发酵24~48h后，离心收集有机相，获得生物合成的β-榄香烯。

20、相对于现有技术，本发明具有如下优点：

21、（1）本发明通过对avgas进行基因工程改造，获得了多种相较于原始gas具有更高催化活性的gas突变体，其中表达单点突变体gas6的毕赤酵母工程菌的β-榄香烯产量相较于表达gas0菌株提高了3.22倍，表达两点突变体gas6-13的毕赤酵母工程菌的β-榄香烯产量相较于表达gas0菌株提高了5.31倍。

22、（2）本发明利用毕赤酵母作为宿主细胞表达gas突变体合成β-榄香烯，其为生物安全菌株，具备天然的倍半萜合成优势，可进行高密度发酵，有助于节省应用成本。