一种毕赤酵母先导发酵制备新梅酒及其制备方法

本发明涉及果酒酿造，具体涉及一种毕赤酵母先导发酵制备新梅酒及其制备方法。

背景技术：

1、新梅（prunusdomestical.）富含多酚、有机酸及可发酵糖，是酿造功能性果酒的优质原料。新梅汁含有充足的可发酵糖（果糖、葡萄糖、蔗糖），ph3.0–3.5处于酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）的耐受范围内（最低可耐ph2.8左右），直接接入酿酒酵母即可正常启动并完成酒精发酵（af），这是新梅酒（plumwine）最常规、最基础的酿造方式。

2、然而，该常规酿造工艺存在以下难以克服的技术缺陷：

3、（1）af终点乙醇含量过高（14–18%v/v）：新梅汁糖度通常高于葡萄汁（20–25°brixvs.18–22°brix），酿酒酵母将其完全转化后，乙醇含量显著高于葡萄酒（12–14%）。高乙醇成为后续苹果酸-乳酸发酵（mlf）的根本性障碍。

4、（2）af终点ph过低（2.8–3.1）：af过程中co2大量溶解形成碳酸，叠加有机酸积累，使ph进一步下降，超出乳酸菌（lab）的耐受极限（ph≥3.2）。

5、（3）mlf无法启动：上述高乙醇（14–18%）与低ph（2.8–3.1）的叠加胁迫，使lab完全无法存活，导致新梅酒始终缺乏mlf产生的双乙酰、乙偶姻等复杂二类香气，风味扁平、酸感尖锐、口感失衡。

6、（4）补氮悖论：新梅汁可同化氮（yan）约80mg/l，低于酿酒酵母最优代谢区间（150–200mg/l）。外源添加磷酸氢二铵（dap）虽可改善af效率、缩短周期，但dap仅提供无机速效氮，不能分流可发酵糖底物，af终点乙醇仍高达14–15%；且dap无缓冲能力，其促进的旺盛代谢反而增加有机酸和co2产量，加剧ph下降；更关键的是，外源铵态氮在af中未被完全同化，残留的游离氨基酸（尤其是组氨酸、酪氨酸）成为mlf中生物胺的前体，带来食品安全隐患。

7、现有技术中，虽有采用非酿酒酵母与酿酒酵母共发酵改善果酒香气的报道，但多限于同步接种或简单复配。同步接种时，非酿酒酵母与酿酒酵母存在氧竞争、氮竞争及底物竞争，非酿酒酵母难以在酿酒酵母的crabtree效应主导下建立有效生态位；且同步接种无法解决af终点乙醇过高的问题，mlf窗口依然缺失。

8、因此，亟需一种能够在af正常完成的前提下，通过底物分流与有机缓释氮源调控，主动控制af终点乙醇及ph参数，为mlf创造可生存窗口的酿造方法，使新梅酒具备类似葡萄酒的复杂二类香气及圆润口感。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种毕赤酵母先导发酵制备新梅酒及其制备方法，该方法以解决以下技术问题：

2、（1）新梅酒常规酿造中af终点乙醇过高（14–18%）、ph过低（2.8–3.1），导致mlf无法启动的技术问题；

3、（2）新梅酒缺乏mlf产生的双乙酰、乙偶姻等复杂二类香气，风味扁平、口感尖锐的技术问题；

4、（3）外源补氮改善af效率与加剧乙醇抑制mlf之间的技术悖论；

5、（4）现有同步接种工艺中非酿酒酵母与酿酒酵母竞争导致代谢调控失效的技术问题；

6、（5）外源dap补氮带来的生物胺积累风险问题。

7、本发明的目的采用如下技术方案实现：

8、一种毕赤酵母先导发酵制备新梅酒的制备方法，包括以下步骤：

9、s1、新梅汁制备：将成熟新梅破碎、压榨，经巴氏杀菌后得到新梅汁；

10、s2、毕赤酵母先导发酵：向所述新梅汁中接入毕赤酵母（pichia pastoris），接种量为105–106cfu/ml，在20–25℃、微氧条件下发酵24–48h，得到毕赤酵母发酵液；所述毕赤酵母利用所述新梅汁中的可发酵糖进行呼吸及增殖代谢，将部分糖类转化为生物质而非乙醇，实现底物分流，同时产生酯类前体物质；

11、s3、毕赤酵母自溶：将所述毕赤酵母发酵液升温至35–40℃，维持6–12h，诱导毕赤酵母细胞自溶，释放胞内氨基酸、核苷酸、维生素及多糖，得到含毕赤酵母自溶物的发酵基质；含毕赤酵母自溶物中的氨基酸、肽类作为两性电解质，赋予发酵基质缓冲容量；

12、s4、酒精发酵：向所述含毕赤酵母自溶物的发酵基质中接入酿酒酵母（saccharomycescerevisiae），接种量为106–107cfu/ml，在18–22℃下进行酒精发酵；由于毕赤酵母先导阶段已分流部分可发酵糖，且所述含毕赤酵母自溶物提供有机缓释氮源使酿酒酵母代谢稳健，配合低温发酵，控制发酵终点乙醇含量为10–12%（v/v），ph为3.2–3.5；

13、s5、苹果酸-乳酸发酵：酒精发酵结束后，接入乳酸菌，接种量为106–107cfu/ml，在18–20℃下进行苹果酸-乳酸发酵，得到新梅酒原酒；

14、s6、后处理：将所述新梅酒原酒经下胶澄清、过滤、陈酿、灌装，得到成品新梅酒，即所述毕赤酵母先导发酵制备新梅酒。

15、进一步地，步骤s2中，所述毕赤酵母为毕赤酵母gs115或毕赤酵母x-33；所述微氧条件为溶解氧0.5–2.0mg/l，搅拌转速50–100rpm。

16、进一步地，步骤s2中，所述毕赤酵母发酵过程中，部分可发酵糖被转化为毕赤酵母生物质，使后续酿酒酵母可利用的还原糖减少8–15%，从而降低酒精发酵终点乙醇含量。

17、进一步地，步骤s2中，所述酯类前体物质包括中链脂肪酸乙酯前体、苯乙醇前体及3-甲基-1-丁醇前体。

18、进一步地，步骤s3中，所述毕赤酵母细胞自溶过程还包括添加毕赤酵母细胞壁裂解酶，所述裂解酶为β-1,3-葡聚糖酶，添加量为0.01–0.05g/l。

19、进一步地，步骤s4中，所述酿酒酵母为酿酒酵母ec1118或酿酒酵母d254；所述酒精发酵通过控制发酵温度为18–20℃、初始糖度为20–22°brix，使发酵终点乙醇含量控制在10.5–11.5%（v/v）。

20、进一步地，步骤s4中，酒精发酵结束后，不经过灭活处理，直接进行步骤s5的苹果酸-乳酸发酵。

21、进一步地，步骤s5中，所述乳酸菌为经驯化的耐酸耐乙醇乳酸菌，所述驯化条件为：在含新梅汁的培养基中连续传代3–5次，筛选存活率>60%的菌株；所述含新梅汁的培养基的ph为3.0、乙醇含量为10%。

22、进一步地，步骤s5中，所述乳酸菌为酒球菌（oenococcus oeni）或植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）；苹果酸-乳酸发酵结束后，苹果酸含量降至2.0g/l以下，乳酸含量升至4.0g/l以上。

23、本发明提供一种毕赤酵母先导发酵制备的新梅酒，采用所述的方法制备得到，所述新梅酒乙醇含量为10–12%（v/v），ph为3.2–3.5，双乙酰含量为0.40–0.55mg/l，乙偶姻含量为1.0–1.6mg/l，生物胺总量<2.0mg/l。

24、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

25、本发明提供的一种毕赤酵母先导发酵制备新梅酒，

26、（1）本发明采用毕赤酵母先导发酵策略，利用毕赤酵母较酿酒酵母更强的耐酸性（最低生长ph可达2.0），使其在新梅汁低ph环境（ph3.0–3.5）中优先建立生态位。毕赤酵母在微氧条件下进行呼吸及增殖代谢，将部分可发酵糖转化为生物质而非乙醇，实现底物分流，使后续酿酒酵母可利用的还原糖减少8–15%。该先导发酵策略从根本上改变了af的底物分配，突破了传统酿造中"高糖必高醇"的技术定势。

27、（2）本发明通过毕赤酵母自溶工艺，将其胞内氨基酸、核苷酸、维生素等含氮物质原位释放，作为酿酒酵母酒精发酵的内源性氮源。该内源性氮源与新梅汁原有yan协同，使总可利用氮达到150–200mg/l，满足酿酒酵母高效代谢需求，避免了外源dap等化学氮源的添加。由于氮源充足且为有机缓释态，酿酒酵母发酵活力稳健，避免了因氮饥饿导致的发酵迟缓风险；配合18–20℃低温af，发酵过程温和可控，有利于保留新梅特征香气物质。通过控制初始可发酵糖度及毕赤酵母底物分流，发酵终点乙醇含量精准控制在10–12%（v/v）。相比之下，传统酿造因未分流底物，酿酒酵母将所有糖类转化为乙醇，导致af终点乙醇高达14–18%。

28、（3）本发明通过毕赤酵母自溶物的缓冲作用（氨基酸、肽类作为两性电解质，抵抗h+积累）、底物分流减少有机酸总生成量、低温af减缓产酸速率，以及自溶阶段升温促使co2逸出等多重机制，将af终点ph维持在3.2–3.5。该参数窗口恰好处于乳酸菌的耐受范围内（乙醇≤12%，ph≥3.2），使mlf得以顺利启动并完成。传统新梅酒af后ph降至2.8–3.1，lab完全无法存活；对比例2（同步接种）及对比例3（外源补氮）的af终点ph亦低于3.0，mlf窗口依然缺失。

29、（4）本发明成功在新梅酒中实现了苹果酸-乳酸发酵（mlf），使酒液中高含量苹果酸（5–10g/l）高效转化为乳酸，总酸度降低，口感由尖锐转为圆润。更重要的是，mlf过程中lab代谢产生双乙酰、乙偶姻、2,3-丁二醇等复杂二类香气物质，使新梅酒具备类似葡萄酒的奶油香、焦糖香及复杂层次感。实验表明，本发明新梅酒双乙酰含量达0.40–0.55mg/l，乙偶姻含量达1.0–1.6mg/l，显著高于传统新梅酒（双乙酰<0.05mg/l，乙偶姻<0.2mg/l）。

30、（5）本发明避免了外源dap的添加，从根本上降低了生物胺的生成风险。毕赤酵母自溶物提供的有机缓释氮源与酿酒酵母代谢需求高度匹配，同化效率高，af结束后游离生物胺前体氨基酸（组氨酸、酪氨酸）残留极少。同时，自溶物氨基酸谱中生物胺前体比例较低，且缓释特性避免了氮过剩导致的特定氨基酸过量积累。实验表明，本发明所得新梅酒生物胺总量<2.0mg/l，远低于国际限量标准（8–10mg/l）。对比例3虽通过添加dap使af效率提高，但外源铵态氮促进脱羧酶阳性菌代谢，且游离氨基酸残留多，生物胺总量高达4.5–5.0mg/l。

31、（6）本发明采用毕赤酵母先导发酵产生的酯类前体与mlf产生的二类香气物质的协同作用，形成了独特的"果香-奶香-奶油香"复合香气特征。感官评价显示，本发明新梅酒整体接受度评分达87–93分，显著高于传统新梅酒（65–72分）、同步接种工艺（73–78分）及外源补氮工艺（68–75分）。

32、（7）本发明工艺中，毕赤酵母自溶物释放的甘露聚糖等多糖物质可作为天然酒石稳定剂，减少酒石酸盐沉淀；同时其抗氧化成分与新梅多酚协同，提高了酒体的氧化稳定性，dpph自由基清除率达66–72%，显著高于对比例（54–59%）。