毕赤酵母、酿酒酵母菌株及其筛选方法和应用

本发明属于微生物发酵和食品深加工，尤其涉及毕赤酵母、酿酒酵母菌株及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、咖啡作为全球重要的经济作物和广受欢迎的饮品，其风味品质是决定产品市场价值的核心因素。在咖啡生豆的初加工过程中，发酵环节扮演着至关重要的角色。发酵不仅能够降解咖啡果胶层，更是微生物利用豆体底物（如糖类、蛋白质）进行代谢，生成有机酸、醇类、酯类等风味前体物质的关键阶段，直接奠定了咖啡最终烘焙后的感官特征。

2、传统咖啡发酵多依赖自然环境中的野生微生物群落。由于环境微生物的高度不可控性，自然发酵极易受到气候、温湿度和加工环境的影响，导致发酵微生态失衡。这不仅使得咖啡批次间品质差异大、风味重现性差，还极易因腐败菌或杂菌的过度繁殖产生过度发酵的酸馊味或泥土味。为了克服自然发酵的不可控性，定向接种发酵技术逐渐应用于精品咖啡的加工中。现有技术中常使用单一商业酵母（如单一酿酒酵母）进行发酵，虽然能提高发酵稳定性，但单一菌株的酶系和代谢途径较为局限，往往只能突出某单一维度的风味（如单纯的酸感或基础的酒香），难以构建出层次立体、香气馥郁且口感醇厚的复合型风味轮廓。

3、近年来，随着消费者对特调及复合风味咖啡需求的增长，将具有独特风味的植物原料（如花卉、果实）与咖啡结合成为创新热点。古树茶花（茶叶树的花朵）富含茶多酚、黄酮类化合物、氨基酸以及独特的挥发性芳香物质（如芳樟醇、香叶醇等），具有清雅的高沸点花香与良好的抗氧化生理活性。然而，目前市场上“茶花风味”咖啡的制备大多采用简单的物理混合手段，例如：采用茶花与烘焙后的咖啡豆进行“窨制”拼配，或直接在咖啡液中添加茶花提取液、糖浆。这些物理干预方式存在明显的物理壁垒与技术缺陷：不仅风味融合度低，香气“浮于表面”且极易在冲煮过程中挥发散失；更重要的是，物理拼配无法促使茶花中的大分子结合态香气前体释放，难以实现咖啡本底风味与茶花特征香气的深度生化融合，导致最终产品口感割裂、缺乏余韵，且茶花的活性成分未能得到高效的生物转化与利用。近年来，利用特定微生物发酵生咖啡豆以提升定向风味，已成为提升咖啡质量的研究热点。例如，专利文件cn121136833a披露了torulaspora delbrueckii的使用情况，以及乳酸菌分阶段发酵，用于制备香茅味咖啡，这种风味咖啡试图通过二次发酵，将菌株与植物基质（香茅菌）将植物香气融入咖啡豆中。然而，该方法却缺少研究对菌株发酵香味和植物基质风味的融合性，缺少准确控制风味的稳定性和协调。cn121780333a的专利文件提出了一种通过微发芽处理与金色豆发酵结合的方法，以改善咖啡的果香。虽然这项技术可以激活咖啡豆内部的酶系统并增强香气前体，但发芽过程会导致咖啡豆的物理结构发生变化，且后续烘焙过程中容易出现加热不均的问题。而且它产生的风味主要集中在果香层面，缺乏针对特定香气物质的能力。此外，专利文件cn121570402a描述了一种利用绿茶粉和咖啡共发酵制备活性产品的技术，重点是增强产品的舒缓和抗氧化效果。 虽然应用涉及多种菌株的混合发酵，但其应用场景主要面向护肤领域，发酵过程涉及咖啡粉碎和过滤处理，无法保持生咖啡豆的完整性，且难以传统意义上的精品咖啡豆加工，其菌株组合难以产生高浓度芳香酯和花香类物质。

4、为了实现花香物质在咖啡生豆内部的有效富集，部分研究尝试在发酵阶段引入植物原料。但若仅靠微生物的自然发酵或单一酵母发酵，菌株发酵风味不协调将难以释放更多的芳香前体，无法形成丰富的酯类物质，花香类物质作为“底香”来承托和锚定茶花的“高香”，容易导致风味单薄，甚至因发酵不当掩盖咖啡自身的优质酸感。

5、因此，本领域迫切需要一种新型的定向共发酵技术，通过筛选具有特定代谢靶向性的非酿酒酵母与酿酒酵母进行组合。利用产酯酵母合成丰富的酯类物质以构建丰满的果香底蕴和提升醇厚度，协同产花香酵母的高效发酵与增强产花香能力，促使古树茶花中的结合态香气物质充分游离并渗入咖啡生豆内部。这对于解决现有茶花咖啡风味分离、香气留存率低的问题，以及开发高附加值的复合风味发酵咖啡具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供毕赤酵母、酿酒酵母菌株及其筛选方法和应用。

2、本发明首先提供了克鲁维毕赤酵母(pichia kluyveri)pb105，于2026年04月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2026700 。

3、同时提供了酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)pb101，于2026年04月16保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2026701 。

4、本发明还提供一种微生物发酵剂，其包含克鲁维毕赤酵母(pichia kluyveri)pb105和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)pb101。

5、本发明的另一目的在于提供一种古树茶花风味咖啡豆的发酵加工方法，所述发酵加工方法包括以下步骤：

6、s1、前处理阶段：将500g卡蒂姆咖啡生豆、35g云南临沧永德古树茶花普洱茶树白茶萎凋蜜生茶茶叶、3g湖北咸宁冻干干桂花；将选取定量的古树茶花和桂花置于研磨机中研磨至80-100目，与卡蒂姆咖啡生豆混合后装入发酵罐，密封后在110℃下高压蒸汽灭菌10分钟，灭菌后置于超净工作台自然冷却至室温后备用；

7、s2、菌液制备阶段：将分别经过活化三代的克鲁维毕赤酵母(pichia kluyveri)pb105和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)pb101离心处理后，用无菌生理盐水调节菌体浓度至，分别取1.5ml克鲁维毕赤酵母pb105菌液和0.5ml酿酒酵母pb101菌液，注入 200ml 无菌水中制成发酵菌液；

8、s3、发酵阶段：将卡蒂姆咖啡生豆、古树茶花粉末、桂花粉末与发酵菌液混合均匀，在28—32℃、65-75%湿度下发酵20-26小时，期间每隔6小时摇匀一次；

9、s4、后处理阶段：分离发酵后的咖啡豆与粉末，将咖啡豆在50-55℃环境下下干燥至水分含量10%-12%，后经烘焙得到古树茶花风味咖啡豆。

10、本发明的进一步技术方案是：所述步骤s1中的灭菌是在110℃下高压蒸汽灭菌10分钟；

11、所述步骤s1中活化菌株所述样的培养基为：克鲁维毕赤酵母pb105和酿酒酵母pb101采用pdb培养基。

12、本发明的进一步技术方案是：所述pdb培养基(1l)为：马铃薯浸出粉12g、葡萄糖20g，加蒸馏水至1l，加入20.0g琼脂为固体培养基(pda培养基）。

13、本发明的另一目的在于提供一种古树茶花风味咖啡豆，由所述发酵加工方法制备获得。

14、本发明的进一步技术方案是：其具有茶花香、桂花香、茶感、果香、花香、坚果香中的至少一种风味或多种复合风味，且，兼具花香、果香与茶感般的甘甜。

15、本发明提供了克鲁维毕赤酵母(pichia kluyveri)pb105和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)pb101和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)pb101在咖啡生豆发酵中的联合应用；或者

16、克鲁维毕赤酵母(pichia kluyveri)pb105和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)pb101在增强咖啡生豆花果香风味、降低咖啡苦涩感中的联合应用。

17、本发明的有益效果是：通过克鲁维毕赤酵母pb105的产酯香特性与酿酒酵母pb101的产花香功能形成协同，结合古树茶花和桂花香的风味物质，使咖啡豆获得茶花香、桂花香、茶感、花果香中的至少一种风味或多种复合风味，苦涩感显著降低，果酸柔和、回甘持久，风味层次远超单一菌种发酵或物理混合产品提升风味品质；采用定向接种复合发酵剂替代自然发酵或单一菌种发酵，发酵参数明确可控，微生物菌群结构稳定，咖啡豆批次间风味差异小、可复现程度高，解决了传统发酵品质不稳定的核心问题,使得发酵过程可控稳定；发酵周期仅需20-26 小时，远低于部分传统发酵工艺，且前处理、发酵、加工步骤简洁，无需复杂设备，适合标准化、工业化生产，降低了生产成本与技术门槛，提高了发酵效率，简化了发酵工艺，创新了加工方法；通过微生物协同发酵实现陈皮风味物质与咖啡本底风味的生物转化与深度融合，避免了物理混合导致的风味分离问题，从高温到中低温饮用均可保持风味协调统一提高了风味融合度。