一种自组装虫草素纳米给药系统及其制备方法与应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种自组装虫草素纳米给药系统及其制备方法与应用。

背景技术：

1、放射治疗（rt）仍是当代癌症治疗的核心组成部分，其治疗作用主要通过在癌细胞中诱导不可修复的dna损伤来实现。然而，单独放射治疗引发的系统性和持久性免疫反应远不能令人满意。一个主要的局限性源于生物组织内在的放射物理特性。大多数肿瘤主要由低原子序数（低z）元素组成，这固有地限制了肿瘤内x射线能量的沉积，并进而减少了放射产生的活性氧（ros）生成。不足的ros生成会减弱免疫原性细胞死亡（icd）的诱导，损害抗原呈递，并最终削弱放疗（rt）后的免疫启动。因此，高z金属纳米材料，特别是含钆纳米结构，已成为有前景的放射增敏剂。凭借其强大的x射线衰减能力，它们能够增强局部剂量沉积并放大ros生成，为克服内在放射生物学抵抗和改善放疗驱动的免疫原性提供了一种合理策略。

2、然而，高z辅助放疗（rt）的增强疗效仍不足以维持抗肿瘤免疫，因为放疗同时建立了抑制性肿瘤微环境（tme），阻碍免疫激活。释放的损伤相关分子模式（damps），包括三磷酸腺苷（atp），通过刺激嘌呤能p2受体促进免疫细胞募集和激活。具有矛盾的是，atp驱动的免疫刺激通常是短暂的，这是由于肿瘤内高外核苷酸酶活性所致。肿瘤细胞和调节性t细胞上经常过表达的cd39和cd73依次将促炎性胞外atp水解为免疫抑制性腺苷（ado）。积累的腺苷与多种免疫亚群上的腺苷a2a受体（a2ar）结合，导致抗原呈递、效应t细胞激活和细胞毒性免疫功能的广泛抑制。因此，放疗诱导的atp释放常被转化为腺苷介导的免疫抑制，形成一种自我限制的反馈循环，损害icd相关的免疫原性活性，并限制全身免疫反应。

3、由于，肿瘤微环境（tme）在促进肿瘤发展中起着关键作用，调节tme的反应是免疫疗法和辅助治疗促进癌症细胞死亡的关键目标。tme除了免疫细胞外，各种可溶性因子也会参与免疫抑制过程。其中腺苷也是促进肿瘤进展的重要免疫抑制因子，其是肿瘤发展的关键决定因素。腺苷对促进肿瘤中新的血管系统、肿瘤生长和转移至关重要。同时腺苷可能会阻止引流lns中dc的成熟。虫草素作为一种具有相关生物活性的腺苷类似物，能抑制一些腺苷依赖的生理过程。虫草素在生物体内有着代谢快的生物利用率低等副作用，生物利用度低导致肿瘤部位虫草素含量较少，无法达到预期的治疗效果。

4、临床前研究已表明，阻断腺苷受体或抑制cd39/cd73活性在逆转腺苷介导的免疫抑制和增强现有癌症治疗效果方面显示出强大作用。虫草素（3′-脱氧腺苷）是从冬虫夏草中分离出的一种生物活性化合物，其结构与腺苷及某些cd73靶向支架高度相似，提示其可能在肿瘤微环境中调节腺苷代谢和信号传导。因此，虫草素已被报道可调节肿瘤生长、免疫反应以及对细胞毒性疗法的敏感性。然而，其转化应用受到腺苷脱氨酶介导的快速降解的限制，需要通过合理的结构稳定来在体内保留其生物活性。

5、因此，亟需开发一种有很好的稳定性和肿瘤滞留能力，能够实现放射化学损伤与免疫代谢抑制的同步调节的纳米给药系统。

技术实现思路

1、本发明所要解决的第一技术问题是提供一种自组装虫草素纳米给药系统，以解决现有技术中虫草素稳定性差、瘤内滞留能力弱、作用机制单一的缺陷，所述给药系统通过增效免疫原性细胞死亡和改善肿瘤微环境激活全身免疫反应；同时，磷酸化和金属配位共同提高了虫草素的稳定性和肿瘤内滞留能力，实现了放射化学损伤与免疫代谢抑制的同步调节。

2、本发明所要解决的第二技术问题是提供上述自组装虫草素纳米给药系统的制备方法。

3、本发明所要解决的第三技术问题是提供上述自组装虫草素纳米给药系统的应用。

4、一种自组装虫草素纳米给药系统的制备方法，包括如下步骤：

5、（1）氮气气氛下，将虫草素与有机碱溶于磷酸酯中，冷却后加入三氯氧磷，经搅拌后进行反应，反应结束后，经淬灭和纯化处理，得到5'-单磷酸虫草素；

6、（2）将步骤（1）得到的5'-单磷酸虫草素的水溶液与钆盐水溶液通过微流控芯片混合，收集流出液，进行冷冻干燥，即得。

7、在一些实施例中，步骤（1）中，所述有机碱为叔胺类有机碱，选自三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、吡啶、n-甲基吗啉、2,6-二甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶中的任意一种或多种，优选为三乙胺；所述虫草素与所述有机碱的摩尔比为1:0.5~5，优选为1:0.8~3，最优选为1：1；所述磷酸酯为无水磷酸三烷基酯，选自磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯、磷酸三异丙酯或磷酸三丁酯中的任意一种或多种，优选为磷酸三甲酯。

8、在一些实施例中，步骤（1）中，所述磷酸酯的用量无特殊要求，将原料溶解和/或分散均匀即可。

9、在一些实施例中，步骤（1）中，加入三氯氧磷的方式为缓慢滴加，滴加时间控制在10 min以内。

10、在一些实施例中，步骤（1）中，所述冷却，其温度为0~4℃，优选为0℃；所述虫草素与所述三氯氧磷的摩尔比为1:1~5，优选为1:1.5~3，进一步优选为1:2。

11、在一些实施例中，步骤（1）中，所述搅拌，其时间为5~10min；所述反应，其温度为0~4℃，优选为0℃，时间为12~15 h，优选为12 h。

12、在一些实施例中，步骤（1）中，所述淬灭为使用水进行；所述纯化包括萃取、离子交换层析、冻干、有机溶剂研磨和干燥；所述萃取使用的溶剂为甲基叔丁基醚；所述离子交换层析为阳离子交换树脂层析，所述阳离子交换树脂优选为dowex 50wx8；所述有机溶剂研磨为在0℃超声条件下使用甲醇进行，所述超声，其功率为40~50 khz，时间为20~30 min；所述干燥，其温度为40~50℃，时间为12~24 h，压力在100 pa以内。

13、在一些实施例中，步骤（2）中，所述5'-单磷酸虫草素的水溶液的浓度为0.5~1.5mmol/l（优选为1 mmol/l），其混合流速为50~200 μl/min，优选为100 μl/min；所述钆盐为水溶性钆盐，选自氯化钆、硝酸钆、醋酸钆或硫酸钆中的任意一种或多种，优选为氯化钆；所述钆盐水溶液的浓度为1.0~3.0 mmol/l（优选为1 mmol/l），其混合流速为100~300 μl/min，优选为150 μl/min。

14、在一些实施例中，步骤（2）中，所述冷冻干燥，其温度为-80~-40℃，时间为12~72h，压力为5~50 pa。

15、本发明还保护上述制备方法制备得到的自组装虫草素纳米给药系统。

16、在一些实施例中，所述自组装虫草素纳米给药系统的平均粒径为35 nm ~ 60 nm，zeta电位为-15 mv ~ -18 mv。

17、上述自组装虫草素纳米给药系统在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用也在本发明的保护范围内。

18、有益效果：

19、（1）本发明构建一种自组装虫草素纳米给药系统，利用虫草素经过合理磷酸化生成虫草素单磷酸酯（ccp），从而能与钆离子稳定配位形成gdccp纳米颗粒。该制备过程采用微流控策略，可生成尺寸更小、均匀性更优的纳米颗粒。

20、（2）本发明提供的gdccp纳米粒中，钆作为高z放疗增敏剂，可增强x射线沉积以产生高水平活性氧（ros），从而有效增强免疫原性细胞死亡（icd）的诱导并促进树突状细胞（dc）成熟；同时，ccp作为一种腺苷模拟调节剂，通过竞争性干扰cd39/cd73介导的转化，降低腺苷积累，从而创造促炎性肿瘤微环境（tme）。

21、（3）磷酸化和金属配位共同提高了虫草素的稳定性和肿瘤内滞留能力，实现了放射化学损伤与免疫代谢抑制的同步调节；通过将增强的ros介导的icd与缓解腺苷驱动的免疫抑制相结合，这一集成平台将放疗处理的肿瘤微环境重编程为持续免疫激活状态，并增强全身抗肿瘤免疫力。这种集成策略为增强放疗驱动的免疫治疗并扩大其治疗效果提供了基于材料的框架。

22、（4）本发明的自组装虫草素纳米给药系统，具有保持药物活性，药效强、副反应发生率低的优点，是实现临床应用的重要前提。