冠突散囊菌素E在制备具有增强的免疫抑制活性的间充质干细胞中的应用的制作方法

本发明涉及间充质干细胞，尤其涉及冠突散囊菌素e在制备具有增强的免疫抑制活性的间充质干细胞中的应用。

背景技术：

1、间充质干细胞（mesenchymal stem cells, msc）核心的免疫调控功能是抑制t细胞异常增殖、活化，同时重塑t细胞亚群平衡。基于上述免疫调控功能，msc在自身免疫病、移植排斥、炎症损伤、器官纤维化等领域具有非常大的临床转化价值，可弥补传统免疫抑制剂存在的副作用大、易耐药、无法修复组织损伤的短板。因此，提高msc对t细胞增殖的抑制能力有望使其在急性/慢性移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, gvhd）、系统性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、类风湿关节炎、肝/肺/肾纤维化等疾病的治疗中发挥更加优良的临床效应。

2、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, ipsc）可诱导分化为具有与原代msc相似的基因型和表型特征的间充质样细胞，即诱导多能干细胞来源间充质干细胞（induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell，imsc），并且在长时间传代中保持稳定而无染色体异常。imsc克服了难以从单一供体获得足够数量的mscs、细胞扩增不可持续以及提取细胞来源的异质性等问题，为msc疗法的临床转化与规模化生产应用奠定了重要基础。

3、然而，imsc固有免疫抑制活性有限，通常需要大剂量输注才能达到治疗效果，显著提升治疗成本，成为限制msc临床广泛应用的核心瓶颈。现有技术中，为提高msc的免疫抑制活性，通常采用以下几类策略，但均存在明显缺陷：

4、第一，基因工程改造：通过病毒载体使msc过表达ido1、hla-g、pd-l1、il-10等免疫调节分子，可在一定程度上增强其免疫抑制能力，但存在载体基因组整合与致瘤性风险、免疫原性、制备工艺复杂、成本高昂等问题，临床转化受到显著限制。

5、第二，物理或工艺手段：例如缺氧培养、三维培养、生物材料包裹等，但对msc免疫抑制活性的提升幅度有限，且往往难以与现有规模化、可放大的细胞制备工艺相互兼容。

6、因此，开发不依赖于基因编辑且更容易与现有细胞制备工艺兼容的提高imsc的免疫抑制活性的方法在msc的临床应用中具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供冠突散囊菌素e在制备具有增强的免疫抑制活性的间充质干细胞中的应用。

2、具体地，本发明提供以下所述的技术方案。

3、第一方面，本发明提供冠突散囊菌素e在制备具有增强的免疫抑制活性的间充质干细胞中的应用；其中，所述间充质干细胞为诱导多能干细胞来源间充质干细胞（imsc）；

4、所述应用包括：采用冠突散囊菌素e对间充质干细胞进行处理；所述处理中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm。

5、冠突散囊菌素e（cristatumin e）是冠突散囊菌素家族成员，是一种天然存在的生物碱，其分子式为c32h36n6o4，cas号为1459722-08-7，化学结构式如式（1）所示：

6、  式（1）。

7、冠突散囊菌素e对间充质干细胞的免疫调节功能的影响尚未有研究报道。本发明意外发现，冠突散囊菌素e能够显著提升间充质干细胞的免疫抑制功能，在间充质干细胞的体外扩增培养中添加冠突散囊菌素e能够制备得到免疫抑制功能明显提高的间充质干细胞，同时，间充质干细胞仍保持原有的细胞属性，其细胞表型（例如cd44、cd73、cd90、cd105的表达情况）以及诱导分化成骨、成软骨、成脂能力等性能未发生改变。

8、优选地，所述采用冠突散囊菌素e对间充质干细胞进行处理包括：采用包含冠突散囊菌素e的间充质干细胞扩增培养基对间充质干细胞进行体外扩增培养。

9、优选地，所述应用包括：采用包含冠突散囊菌素e的间充质干细胞扩增培养基对间充质干细胞进行扩增培养；所述间充质干细胞扩增培养基中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm。

10、其中，所述扩增培养为传代至少1-3次。

11、本发明中，冠突散囊菌素e对间充质干细胞的免疫抑制活性的提升作用不依赖于特定的间充质干细胞扩增培养基组成，因此，可采用任意能够用于间充质干细胞扩增培养的培养基。

12、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：45%-50% imdm培养基、45%-50% ham’s f12、2%-8% 人血白蛋白、0.5%-2% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、8-12ng/ml fgf-2以及8-12ng/ml egf。

13、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：45%-50% imdm培养基、45%-50% ham’s f12、4%-6% 人血白蛋白、0.8%-1.2% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、9-11ng/ml fgf-2以及9-11ng/ml egf。

14、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：47%imdm培养基、47% ham’s f12、5% 人血白蛋白、1% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、10ng/mlfgf-2以及10ng/ml egf。

15、优选地，所述增强的免疫抑制活性表现为：与未经冠突散囊菌素e处理的间充质干细胞相比，经冠突散囊菌素e处理的间充质干细胞对cd4+t细胞增殖的抑制活性，imsc表达免疫抑制分子ido1和抗炎因子tgfβ1的水平提高。

16、第二方面，本发明提供冠突散囊菌素e在制备提高间充质干细胞的免疫抑制活性的制剂中的应用；其中，所述间充质干细胞为诱导多能干细胞来源间充质干细胞。

17、优选地，所述制剂用于在体外制备具有增强的免疫抑制活性的间充质干细胞。

18、优选地，所述制剂具有提高间充质干细胞对cd4+t细胞增殖的抑制活性的功能。

19、第三方面，本发明提供冠突散囊菌素e在制备提高间充质干细胞对t细胞增殖的抑制活性的制剂中的应用；其中，所述间充质干细胞为诱导多能干细胞来源间充质干细胞。

20、优选地，所述t细胞为cd4+t细胞。

21、优选地，所述制剂用于在体外制备具有增强的cd4+t细胞增殖抑制活性的间充质干细胞。

22、第四方面，本发明提供冠突散囊菌素e在体外提高间充质干细胞的免疫抑制活性中的应用；其中，所述间充质干细胞为诱导多能干细胞来源间充质干细胞。

23、所述应用包括：采用冠突散囊菌素e对间充质干细胞进行处理；所述处理中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm。

24、第五方面，本发明提供冠突散囊菌素e在体外提高间充质干细胞对t细胞增殖的抑制活性中的应用；其中，所述间充质干细胞为诱导多能干细胞来源间充质干细胞。

25、所述应用包括：采用冠突散囊菌素e对间充质干细胞进行处理；所述处理中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm。

26、优选地，所述应用包括：采用包含冠突散囊菌素e的间充质干细胞扩增培养基对间充质干细胞进行扩增培养；所述间充质干细胞扩增培养基中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm。

27、优选地，所述t细胞为cd4+t细胞。

28、第六方面，本发明提供一种在体外提高间充质干细胞对t细胞增殖的抑制活性的方法，所述方法包括：采用冠突散囊菌素e对间充质干细胞进行处理；所述处理中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm；所述间充质干细胞为诱导多能干细胞来源间充质干细胞。

29、优选地，所述方法包括：采用包含冠突散囊菌素e的间充质干细胞扩增培养基对间充质干细胞进行体外扩增培养；所述间充质干细胞扩增培养基中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm。

30、其中，所述扩增培养为传代至少1-3次。

31、本发明中，冠突散囊菌素e对间充质干细胞的免疫抑制活性的提升作用不依赖于特定的间充质干细胞扩增培养基组成，因此，可采用任意能够用于间充质干细胞扩增培养的培养基。

32、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：45%-50% imdm培养基、45%-50% ham’s f12、2%-8% 人血白蛋白、0.5%-2% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、8-12ng/ml fgf-2以及8-12ng/ml egf。

33、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：45%-50% imdm培养基、45%-50% ham’s f12、4%-6% 人血白蛋白、0.8%-1.2% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、9-11ng/ml fgf-2以及9-11ng/ml egf。

34、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：47%imdm培养基、47% ham’s f12、5% 人血白蛋白、1% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、10ng/mlfgf-2以及10ng/ml egf。

35、上述方法为非疾病治疗目的的方法。

36、第七方面，本发明提供一种间充质干细胞的制备方法，所述方法包括：采用包含冠突散囊菌素e的间充质干细胞扩增培养基对间充质干细胞进行体外扩增培养；所述间充质干细胞扩增培养基中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm；所述间充质干细胞为诱导多能干细胞来源间充质干细胞。

37、本发明中，冠突散囊菌素e对间充质干细胞的免疫抑制活性的提升作用不依赖于特定的间充质干细胞扩增培养基组成，因此，可采用任意能够用于间充质干细胞扩增培养的培养基。

38、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：45%-50% imdm培养基、45%-50% ham’s f12、2%-8% 人血白蛋白、0.5%-2% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、8-12ng/ml fgf-2以及8-12ng/ml egf。

39、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：45%-50% imdm培养基、45%-50% ham’s f12、4%-6% 人血白蛋白、0.8%-1.2% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、9-11ng/ml fgf-2以及9-11ng/ml egf。

40、在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞扩增培养基包括如下组分：47%imdm培养基、47% ham’s f12、5% 人血白蛋白、1% 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、10ng/mlfgf-2以及10ng/ml egf。

41、第八方面，本发明提供一种制备具有增强的免疫抑制活性的间充质干细胞的方法，所述方法包括：采用包含冠突散囊菌素e的间充质干细胞扩增培养基对间充质干细胞进行体外扩增培养；所述间充质干细胞扩增培养基中，冠突散囊菌素e的浓度为0.1-1µm；所述间充质干细胞为诱导多能干细胞来源间充质干细胞。

42、本发明的有益效果至少包括：本发明发现冠突散囊菌素e能够显著提高imsc对t细胞增殖的抑制能力，进而显著提高imsc的免疫抑制活性，同时冠突散囊菌素e不影响imsc的细胞属性。经验证，冠突散囊菌素e处理前后，imsc表面cd44、cd73、cd90、cd105的表达均高于95%，且三系分化能力未见明显变化；冠突散囊菌素e处理使imsc细胞对cd4+t细胞的平均增殖抑制率从47.41%提高至65%以上，抑制效果提高了38.2%。本发明提供的制备具有增强的免疫抑制活性的间充质干细胞的方法的工艺简单易行、成本低廉，适于间充质干细胞制备的实际应用。