基因修饰的调节性T细胞的制作方法

本发明涉及对抗同种异体“现货型”调节性t细胞产品免疫原性的多重策略。

背景技术：

1、t细胞产品的过继转移已发展成为一种有前景的免疫疗法，有望治愈严重的慢性疾病，从而无需终身治疗。一些抗癌t细胞，例如cd19特异性或bmca特异性car-t细胞，已被批准用作治疗产品，目前数百项采用先进方法的临床试验正在进行中。

2、到目前为止，自体方法占据主导地位，即细胞产品的起始产品取自患者自身，并在gmp生产过程中进行富集、修饰和扩增。然后将制备好的自体产品施用于同一患者。对抗感染记忆/效应t细胞产品也采用类似的方法。

3、这些流程在物流方面具有挑战性，在既往接受过大量治疗的患者中存在局限，而且成本非常高昂。因此，正在开发使用来自健康个体或ipsc的起始材料的现货型同种异体疗法。然而，这些产品的（同种异体）免疫原性构成了一个挑战，至少对于免疫功能未严重受损的患者（例如造血干细胞移植后的患者）而言，因为同种异体细胞产品通常会被排斥。

4、调节性t细胞（treg）是t细胞产品中完全不同的一类。与上述抗癌或抗感染t细胞不同，它们不用于免疫重建，而是用于治疗不期望的免疫反应，例如移植后、基因治疗后或自身免疫、过敏或再生受损等疾病中出现的免疫反应。treg是细胞免疫系统的天然“和平缔造者”，可以通过细胞接触介导的因素和分泌性因子使紊乱的免疫调节恢复平衡。与效应t细胞类似，目前患者主要使用自体treg产品。迄今为止，只有免疫功能严重受损的患者，例如接受造血干细胞治疗（hsct）后的患者，才接受了同种异体treg治疗。人们曾希望treg固有的免疫抑制特性能够预防/抑制细胞转移受者对现货型treg产品产生的同种异体反应。然而，在具有临床相关性的人源化小鼠模型中，现货型treg产品具有显著的免疫原性，导致转移细胞的功能和存活能力丧失（参考文献8）。

5、其中，发明人在人免疫系统（his）小鼠模型中证明，尽管调节性t细胞（treg）具有固有的免疫调节特性，但它们表现出的同种异体免疫原性与针对肿瘤或感染性病原体的常规t细胞相似。换句话说，它们会被宿主的人免疫系统识别和清除，使得直接作为现货型产品使用无效（参考文献8；mccallion等人，2023）。发明人还证明，通过敲除hla i类和ii类分子（以防止被宿主t细胞识别）并敲入多态性较低的hla-e分子（以防止被宿主nk细胞排斥），使用“隐形”treg可以使现货型treg逃避同种异体排斥（失去同种异体免疫原性），并获得与自体treg类似的功能数据（参考文献8）。

6、现货型同种异体treg产品在治疗各种炎症性病症方面具有巨大潜力，然而，在许多（自身免疫性）疾病中，treg功能受损，这目前限制了具有潜在免疫原性的自体制剂的使用。

7、与最常用的自体疗法相比，现货型同种异体t细胞疗法在成本、物流挑战、细胞产品质量和可扩展性方面将具有许多优势。要实现这一目标，必须克服两个重要障碍：

8、-现货型t细胞产品的同种异体免疫原性，这会导致在激活该产品的同种异体反应性（宿主反应性）t细胞受体后宿主免疫系统对其产生排斥反应（宿主抗移植反应）

9、-现货型t细胞产品对宿主组织的同种异体反应性（移植物抗宿主反应）

10、基于上述现有技术，本发明的目的是提供降低基于调节性t细胞的细胞疗法的免疫原性的手段和方法。本说明书的独立权利要求所述的主题实现了该目的，而从属权利要求、实施例、附图和本说明书的一般性描述中描述了其他有利的实施方式。

技术实现思路

1、本发明涉及一种用于基因和细胞治疗的先进治疗药物产品（atmp）——一种调节性t细胞，其特征在于ii类主要组织相容性复合体转录激活因子基因（ciita）（hla ii类）以及hla i类基因座hla-a、hla-b和hla-c中的一个或两个发生基因缺失或基因沉默，特别是基因敲低或基因敲除。与hla基因座的完全敲低相比，部分敲低这些基因座可以更容易地匹配供者和受者，尤其是在使用人工智能（ai）工具的情况下。

2、在某些具体实施方式中，根据本发明的基因编辑的调节性t细胞的特征在于第二项基因修饰，该修饰通过对免疫抑制药物相应的分子靶点进行基因沉默/敲除，赋予细胞对该药物的抗性，特别是对选自由他克莫司、环孢素和类固醇组成的组中的一种药物的抗性（图5）。

3、实施例中显示的数据表明，为了逃避免疫识别，无需完全“隐形帽”（敲除全部hla细胞i+ii）；完全“隐形帽”伴随着重大的固有风险，即这些隐形帽细胞发生肿瘤形成或病毒感染时缺乏免疫监视（表1和2）。

4、本说明书中的数据进一步显示，免疫抑制疗法（如使用钙调神经磷酸酶抑制剂，以防止排斥）与对免疫抑制剂具有抗性的treg（以防止treg的存活受损和功能受损）的组合是有效的（表2）。

5、暂时性免疫抑制与部分隐形（敲除3个hla i类基因中的2个，伴或不伴hla ii类敲除）相结合，在防止同种异体treg被排斥的同时维持其存活和功能方面最为有效。

6、术语和定义

7、通用

8、为了解释本说明书，将适用以下定义，并且在适当的情况下，单数形式的术语也将包括复数形式，反之亦然。如果以下任何定义与本文通过引用并入的任何文件相冲突，则以以下定义为准。

9、本文中使用的“包含”、“具有”、“含有”和“包括”等词语以及其他类似形式和语法等同形式，其含义应相同，且应为开放式，即这些词语后面的一项或多项内容并非旨在穷尽该项或这些内容，也并非旨在仅限于所列内容。例如，“包含”组分a、b和c的物品可以由组分a、b和c组成（即仅含有这些组分），也可以不仅含有组分a、b和c，还含有一个或多个其他组分。因此，本文意在使“包含”及其类似形式和语法等同形式被理解为包括对“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方式的公开。

10、当给出数值范围时，应理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限与下限之间的每个中间值（精确至下限所用单位的十分之一），以及该范围内任何其他明确列出的数值或中间值，均包含在本公开中，但所述范围中明确排除的界限除外。当所述范围包括一个或两个端点时，排除所包括的任一或两个端点的范围也包括在本公开中。

11、本文中提及的“约”某个值或参数包括（并描述）针对该值或参数本身的各种变化。例如，提及“约x”的描述包括对“x”的描述。

12、如本文（包括所附权利要求）中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确规定。

13、本文中使用的“和/或”应理解为明确记载了两个指定特征或组分中的每一个，无论其是否与另一个同时存在。因此，本文中诸如“a和/或b”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”（单独）和“b”（单独）。同样，在“a、b和/或c”等短语中使用的“和/或”一词旨在涵盖以下各个方面：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a（单独）；b（单独）；以及c（单独）。

14、除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义（例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学、有机合成中）。分子、遗传和生物化学方法（参见sambrook等人，《分子克隆：实验手册》，第4版（2012年），冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港；以及ausubel等人，《分子生物学简明实验方案》（2002年），第5版，john wiley & sons, inc.）和化学方法均采用标准技术。

15、本文引用的任何专利文件均应视为以引用方式全文并入本文。

16、普通分子生物学：核酸序列，表达

17、基因一词是指含有至少一个开放阅读框（orf）的多核苷酸，该开放阅读框在转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白质。可以使用多核苷酸序列来识别与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。本领域技术人员已知分离较大片段序列的方法。

18、在本说明书中，“转基因”一词是指从一个生物体转移到另一个生物体的基因或遗传物质。在本上下文中，该术语还可以指将遗传序列的天然或生理上完整的变体转移到缺少该变体的患者组织中。它还可以指转移天然编码序列，该序列的表达是由靶组织中不存在或沉默的启动子驱动的。

19、在本说明书中，“重组”一词是指经一个或多个克隆、限制性酶切和/或连接步骤产生的、与天然存在的核酸不同的核酸。重组病毒颗粒包含重组核酸。

20、术语基因表达或表达，或者术语基因产物，可指生成核酸（rna）的过程和生成肽或多肽的过程中的任一者或两者及其产物，这两个过程也分别称为转录和翻译；或者指调控遗传信息加工以产生多肽产物的任何中间过程。术语基因表达也可用于rna基因产物的转录和加工，例如调控性rna或结构性rna（例如核糖体rna）。如果表达的多核苷酸来源于基因组dna，则表达可能包括真核细胞中mrna的剪接。表达可以在转录和翻译水平上进行检测，换句话说，在mrna和/或蛋白质产物水平上进行检测。

21、本说明书中术语“沉默基因”涵盖“敲低基因”和“敲除基因”二者，指的是合成生物学领域已知的技术：

22、基因敲低是指部分降低基因表达，通常是在mrna水平上，导致相应蛋白质的产量减少。这通常使用rna干扰（rnai）技术来实现，例如小干扰rna（sirna）或短发夹rna（shrna），它们与靶mrna结合，促进其降解或抑制其翻译。另一种方法是使用反义寡核苷酸，它可以与mrna杂交并阻断翻译。基因敲低通常是暂时的或可逆的，因此可用于研究基因功能，而不会永久改变基因组。

23、相比之下，基因敲除涉及基因的完全失活或缺失，导致相应蛋白质完全缺失。这通常是通过crispr-cas9、talen或锌指核酸酶（zfn）等基因组编辑技术实现的，这些技术在dna中引入靶向双链断裂，并通过非同源末端连接等易错修复机制导致移码突变或缺失。基因敲除模型，特别是小鼠基因敲除模型，被广泛用于研究中，通过观察永久性基因缺失的影响来研究基因功能和疾病机制。

24、通过调节特定基因的表达来修饰细胞以治疗疾病的方法包括但不一定限于以下方法：

25、-rna干扰（rnai）：该方法利用小干扰rna（sirna）或微rna（mirna）靶向并降解特定的mrna分子，从而阻止靶基因翻译成蛋白质。rnai试剂可通过重组核酸表达载体的转录在细胞内产生。

26、-crispr-cas9基因编辑或碱基编辑：crispr-cas9和源自细菌防御机制的相关系统可以被编程来靶向特定的dna序列，从而可以在精确的位置切割dna。这可以用来破坏基因功能或纠正突变。

27、-反义寡核苷酸（aso）：这些是短的合成dna链，它们与rna转录本结合，阻止rna翻译成蛋白质。它们还可以被设计用来调节rna剪接。

28、-锌指核酸酶（zfn）和转录激活因子样效应物核酸酶（talen）：这些是经过工程化改造的蛋白质，可以进行定制以结合特定的dna序列，从而实现靶向基因破坏。

29、发明的详细描述

30、本领域已知基于调节性t细胞的治疗产品，并且已证明其能够使移植受者接受最低剂量的免疫抑制治疗（参考文献10），并减轻长期接受免疫抑制的患者中针对巨细胞病毒（cmv）感染所致移植并发症的炎症反应（参考文献13）。这些细胞用于抑制受者中不期望的抗自身、抗过敏原免疫反应，或在某些情况下抑制抗病毒或抗移植物免疫反应。因此，根据本发明的基因修饰的调节性t细胞表现出treg的典型特征，包括cd4+cd25+foxp3+表型，并且在多克隆刺激后不会产生升高的th1细胞因子。本文所述的修饰通过调节hla i类和ii类的表达来确保有效植入。

31、本发明的第一方面涉及一种基因修饰的调节性t细胞，其特征在于hla i类基因座hla-a、hla-b和hla-c中的一个或两个发生基因缺失或基因沉默，特别是基因敲低或基因敲除。换言之，hla i类基因座hla-a、hla-b和hla-c中至少有一个表达。

32、在某些实施方式中，ii类主要组织相容性复合体转录激活因子基因（ciita）（hlaii类）在细胞中也被沉默。

33、在某些实施方式中，ii类主要组织相容性复合体转录激活因子基因（ciita）（hlaii类）在细胞中未被沉默，而是以野生型水平或接近野生型水平表达。

34、优选地，消除hla基因座的表达是通过对hla-a基因、hla-b基因和/或hla-c基因中的一个或至多两个基因以及另外的ciita基因进行靶向诱变、基因沉默或基因敲低而实现的。由此产生的基因修饰的调节性t细胞产品仅表达来自1个或至多2个基因座的免疫原性hla蛋白，从而产生2至4个单倍型，避免了匹配hla i类和ii类的12个单倍型的需要。由此产生的细胞产品与基于人工智能的单倍型匹配工具更加兼容，该工具被配置为将受者与免疫原性潜力较低的产品相匹配。

35、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征是hla-a和hla-b基因座的基因沉默，并且hla-c表达。

36、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征是hla-a基因座的基因沉默，而hla-b和hla-c则表达。

37、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征是hla-b基因座的基因沉默，而hla-a和hla-c则表达。

38、在某些具体实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于ciita基因以及hla-a和hla-b基因座的基因敲低或基因敲除。

39、在一些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于ciita基因以及hla-b和hla-c基因座的基因敲低或基因敲除。

40、在一些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于ciita基因以及hla-a和hla-c基因座的基因敲低或基因敲除。

41、在一些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征是ciita基因和hla-a基因座的基因敲低或基因敲除，同时保留hla-b和hla-c的表达。

42、在一些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于ciita基因和hla-b基因座的基因敲低或基因敲除，同时保留hla-a和hla-c的表达。

43、在一些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征是ciita基因和hla-c基因座的基因敲低或基因敲除，同时保留hla-a和hla-b的表达。

44、在某些具体实施方式中，根据参考文献8和15中公开的方法，使用crispr-cas9衍生的腺嘌呤碱基编辑器（abe）沉默ciita基因。

45、在某些具体实施方式中，基因编辑的调节性t细胞产品保留了在人群中非常常见表达的hla基因座的表达，例如hla-a*01或hla-a*02。

46、移植受者需要接受免疫抑制药物治疗以防止器官排斥，并且还可以帮助表达car或tg tcr的基因修饰t细胞等细胞治疗产品植入。传统的免疫抑制药物治疗包括三类免疫抑制剂：增殖抑制剂霉酚酸（mpa），它还能抑制促炎细胞因子的产生，诱导淋巴细胞凋亡并减少t细胞的归巢。钙调神经磷酸酶抑制剂（cni；例如他克莫司和环孢素，也称为环孢素a）能有效降低t细胞活化、成熟和细胞因子分泌。糖皮质激素会抑制t细胞产生细胞因子，并诱发淋巴细胞凋亡。在移植受者中，预先形成的同种异体抗原反应性效应t细胞尤其难以控制。cni是目前持续抑制这些同种异体抗原反应细胞的最有效治疗方法。因此，需要在克服对保护性抗病毒t细胞反应的抑制的同时，维持对同种异体移植物反应性t细胞的控制的解决方案。

47、皮质类固醇是器官移植中必不可少的免疫抑制剂，用于诱导治疗、维持治疗和治疗急性排斥反应。在这种情况下，最重要的皮质类固醇是泼尼松（或其活性形式泼尼松龙）和甲泼尼龙，而地塞米松的作用则较为有限。由于泼尼松能有效抑制t细胞介导的免疫反应，因此常用于长期口服维持治疗；而大剂量静脉注射甲泼尼龙常用于围手术期或急性排斥反应期间，以快速抑制免疫反应。这些皮质类固醇通常不作为单一疗法使用，而是作为与钙调神经磷酸酶抑制剂（如他克莫司或环孢素）和抗代谢药物（如吗替麦考酚酯或硫唑嘌呤）联合使用的组成部分，以达到协同免疫抑制作用并降低器官排斥的风险。

48、在某些具体实施方式中，消除了ciita和1或2个hla基因座的基因产物的基因修饰的调节性t细胞对免疫抑制药物具有抗性。本领域已知，赋予细胞对免疫抑制药物抗性的基因沉默方法，在与免疫抑制联合使用时有助于细胞治疗产品的植入，特别是在移植后。例如，通过破坏糖皮质激素受体的表达（参考文献14）而对糖皮质激素治疗（如地塞米松）产生抗性，或者通过对fkb12的抗性赋予对他克莫司和/或环孢素的抗性。

49、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞对他克莫司具有抗性。

50、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于fkp12的基因敲低或基因敲除。在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞通过amini等人2021年（13）所述的基于成簇规律间隔短回文重复序列（crispr）-cas9的无载体方案获得，该方案用于靶向并敲除衔接蛋白fk506结合蛋白12（fkbp12）的基因，该蛋白是他克莫司发挥免疫抑制功能所必需的。例如，可以通过锌指蛋白，或者通过电穿孔将核糖核蛋白复合物瞬时递送到cmv特异性t细胞中来实现这一目标。

51、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞对环孢素具有抗性。

52、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于钙调神经磷酸酶的基因敲低或基因敲除。在其他实施方式中，通过表达编码对他克莫司不敏感的钙调神经磷酸酶蛋白修饰变体的转基因，使基因修饰细胞对他克莫司不敏感。

53、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞对mtor抑制剂具有抗性。

54、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于编码类固醇受体的基因的基因沉默、诱变或基因敲低。在某些具体实施方式中，编码类固醇受体的基因为糖皮质激素受体基因。

55、皮质类固醇，特别是泼尼松、甲泼尼龙，偶尔还有布地奈德，广泛用于器官移植后的免疫抑制治疗。它们被用于诱导治疗、维持免疫抑制以及治疗急性排斥反应。这些药物通过基因组和非基因组机制抑制促炎细胞因子和抑制t细胞活化，从而发挥其作用。泼尼松、甲泼尼龙和其他糖皮质激素主要通过糖皮质激素受体（gr）发挥作用，gr是一种配体依赖性转录因子，可调节基因表达以抑制免疫反应，包括细胞因子产生和t细胞活化。

56、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于钙调神经磷酸酶和fkb12的基因敲低或基因敲除。

57、fkbp-12（fk506结合蛋白12）在正常人体细胞中组成性表达，并广泛分布于各种组织中。fkbp-12与他克莫司（fk506）结合形成复合物，抑制钙调神经磷酸酶，钙调神经磷酸酶是一种钙依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，对t细胞活化至关重要。

58、钙调神经磷酸酶是一种钙和钙调蛋白依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，在细胞信号传导中起着核心作用。钙调神经磷酸酶在细胞内钙离子水平升高时被激活，并与钙调蛋白结合。它调节各种组织中钙依赖性过程，包括免疫系统、神经系统和心血管系统。钙调神经磷酸酶使活化t细胞核因子（nfat）家族成员去磷酸化，从而使其易位到细胞核中。这会激活对t细胞活化至关重要的基因的转录，例如白细胞介素-2（il-2），而白细胞介素-2对免疫反应至关重要。

59、钙调神经磷酸酶抑制剂（cni），如环孢素a（csa）和他克莫司（fk506），与细胞内蛋白质（亲环蛋白或fkbp-12）结合形成复合物，从而抑制钙调神经磷酸酶的磷酸酶活性。这可以阻止nfat去磷酸化和核易位。

60、本领域已知实现基因沉默、突变或敲除的手段，可通过这些手段调节根据本发明的基因修饰的调节性t细胞中的hla基因座和/或药物靶蛋白。这些方法包括逆转录病毒表达、rna干扰和基于crispr的策略。在某些具体实施方式中，采用无载体基因编辑方法，靶向，例如ciita、hla基因座和/或免疫抑制药物靶点（如fkbp12基因），以制备免疫原性低且具有药物抗性的t细胞。可以通过转染由crispr相关蛋白9（cas9）和相应的单向导rna（sgrna）组成的核糖核蛋白（rnp）复合物来实现高效的基因编辑（有关方案参阅参考文献13）。在某些具体实施方式中，采用rnp核转染步骤。

61、在某些实施方式中，基因修饰的调节性t细胞不包含编码hla-e α链（uniprotp13747）或其变体的转基因。在其他实施方式中，基因修饰的调节性t细胞不包含编码hla-e胞外结构域或与hla-e胞外结构域相似度超过95%的变体多肽的转基因。

62、在某些实施方式中，该细胞的特征是编码人β2-微球蛋白的基因的野生型表达。

63、在某些实施方式中，根据本发明的基因修饰的调节性t细胞包含一种t细胞受体，该t细胞受体被表征为内源性t细胞受体。可以根据已知方案从患者中富集内源性调节性t细胞（例如参见参考文献10、12），并根据本发明进行基因改变，使其仅展示部分hla分子。

64、在其他实施方式中，基因修饰的调节性t细胞从转基因表达盒表达嵌合抗原受体（car）。在一些实施方式中，根据本发明的调节性t细胞表达嵌合抗原受体蛋白，该嵌合抗原受体蛋白包含以下结构成分：

65、a.信号肽，

66、b.靶标特异性识别结构域，特别是其中所述靶标选自肿瘤相关表面抗原、谱系特异性抗原、组织特异性表面抗原或病毒特异性表面抗原，

67、c.包含跨膜区和一个或多个细胞内信号传导结构域、特别是cd3ζ信号传导结构域的效应结构域，以及

68、d.连接结构域（b）和结构域（c）的接头区。

69、在其他实施方式中，基因修饰的调节性t细胞从转基因表达盒表达转基因t细胞受体（tgtcr）。在一些实施方式中，修饰的t细胞表达转基因t细胞受体（tgtcr）。

70、在某些实施方式中，根据本发明的基因编辑的调节性t细胞的特征在于其具有t细胞受体（tcr），该tcr可识别选自组织特异性表面抗原、自身抗原、炎症分子、同种异体抗原、源自核酸表达载体的产物或基因治疗产品表达的转基因的靶标。

71、在某些实施方式中，基因编辑的t细胞来源于外周血细胞。在某些实施方式中，基因编辑的t细胞来源于胸腺t细胞。在某些实施方式中，基因编辑的t细胞来源于诱导多能干细胞（ipsc）。

72、另一方面涉及根据上述任一实施方式所述的重组细胞，其用于同时接受（或在治疗前一周内或治疗后一周内接受）免疫抑制药物治疗的受试者。

73、在一些具体实施方式中，患者已被诊断患有自身免疫性疾病、过敏性疾病，或接受了骨髓移植、组织移植或免疫原性体内基因治疗产品。

74、在一些具体实施方式中，基因工程细胞被提供用于同时接受另外的t细胞治疗产品治疗的患者，该患者可能或已经对该产品产生免疫不耐受（例如，hla不匹配的细胞治疗产品）。

75、此外，还提供了一种组合药物，其包含根据本文任一方面和实施方式所述的基因修饰的调节性t细胞和免疫抑制药物。

76、在组合药物或某些具体实施方式中，免疫抑制药物治疗选自他克莫司、环孢素、mtor抑制剂、皮质类固醇、激酶抑制剂和/或消耗t细胞的单克隆抗体的组中。在一些具体实施方式中，免疫抑制药物治疗为他克莫司和/或环孢素（环孢素a）。

77、本发明的另一个方面是根据本发明的基因编辑的调节性t细胞或者包含所述调节性t细胞和免疫抑制药物的组合药物，用于已被诊断患有自身免疫性疾病的患者。

78、本发明的另一个方面是根据本发明的基因编辑的调节性t细胞或者包含所述调节性t细胞和免疫抑制药物的组合药物，用于已被诊断患有过敏性疾病的患者。

79、本发明的另一个方面是根据本发明的基因编辑的调节性t细胞或者包含所述调节性t细胞和免疫抑制药物的组合药物，用于接受骨髓移植的患者。

80、用于治疗癌症或病毒感染的细胞疗法的植入以表达car或tg tcr等外来物质为特征，其疗效可能受到抗-细胞疗法的免疫反应的限制。本发明的另一个方面是基因编辑的调节性t细胞或包含所述调节性t细胞和免疫抑制药物的组合药物，用于接受细胞治疗的患者。

81、本发明的另一个方面是根据本发明的基因编辑的调节性t细胞或者包含所述调节性t细胞和免疫抑制药物的组合药物，用于接受组织移植的患者。在一些具体实施方式中，提供基因编辑细胞或组合用于接受过肾移植的患者。

82、根据本发明的制造方法和治疗方法

83、本发明还涵盖一个附加方面，即本文所述基因修饰细胞在制备用于治疗或预防需要同时接受免疫抑制药物治疗的病症的药物的方法中的用途。

84、同样，本发明涵盖治疗已被诊断患有需要同时接受免疫抑制药物治疗的病症的患者的方法，该方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本文详细说明的基因修饰细胞。

85、本发明还包括以下项目：

86、1.一种基因修饰的调节性t细胞，其特征在于下列基因发生基因缺失或基因沉默，特别是基因敲低或基因敲除：

87、-ii类主要组织相容性复合体转录激活因子基因（ciita）；以及

88、-hla i类基因座hla-a、hla-b和hla-c中的一个或至多两个。

89、2.根据第1项所述的基因修饰的调节性t细胞，其中，基因修饰的调节性t细胞的特征在于ciita基因以及hla-a和hla-b基因座的基因敲低或基因敲除。

90、3.根据第1项或第2项所述的基因修饰的调节性t细胞，其中，所述基因修饰的调节性t细胞对免疫抑制药物具有抗性。

91、4.根据第3项的基因修饰的调节性t细胞，其中，基因修饰的调节性t细胞对他克莫司和/或mtor抑制剂具有抗性。

92、5.根据前述任一项所述的基因修饰的调节性t细胞，其中，所述基因修饰的调节性t细胞的特征在于fk506结合蛋白12基因（fkbp12）的基因敲低或基因敲除。

93、6.根据第3项至第5项中的任何一项的基因修饰的调节性t细胞，其中，免疫抑制药物为环孢素。

94、7.根据前述任一项所述的重组调节性t细胞，其中，所述重组调节性t细胞的特征在于钙调神经磷酸酶和/或编码类固醇受体的基因的基因敲低或基因敲除。

95、8.根据前述任一项所述的基因修饰的调节性t细胞，其中，所述基因修饰的调节性t细胞的特征在于钙调磷酸酶和fkb12的基因敲低或基因敲除。

96、9.根据前述任一项的基因修饰的调节性t细胞，其中，基因修饰的调节性t细胞不包含编码hla-e的转基因。

97、10.根据前述任一项的基因修饰的调节性t细胞，其特征在于编码人β2-微球蛋白的基因的野生型表达。

98、11.根据前述任一项所述的基因修饰的调节性t细胞，其包含具有以下特征的t细胞受体：

99、-内源性t细胞受体，

100、-嵌合抗原受体（car），和/或

101、-转基因t细胞受体（tgtcr）。

102、12.根据前述任一项的基因修饰的调节性t细胞，其中t细胞来源于外周血细胞、胸腺t细胞或诱导多能干细胞（ipsc）。

103、13.根据第1至12项中任一项所述的基因修饰细胞，用于同时接受（或在治疗前一周内或治疗后一周内接受）免疫抑制药物治疗的受试者。

104、14.用于第13项所述用途的基因修饰的t细胞，其中，患者已被诊断患有自身免疫性病症、过敏性病症，或为骨髓移植、细胞治疗或组织移植的受者。

105、15.一种组合药物，包含根据第1至14项中任一项所述的基因修饰的调节性t细胞和免疫抑制药物，特别是其中所述免疫抑制药物选自他克莫司、环孢素、mtor抑制剂、皮质类固醇、激酶抑制剂和/或消耗t细胞的单克隆抗体的组中，

106、更具体地，其中免疫抑制剂是他克莫司和/或环孢素。

107、本文中凡将单个可分离特征的替代方案列为“实施方式”之处，均应理解为这些替代方案可以自由组合，形成本文所公开的本发明的各个具体实施方式。

108、以下实施例和图示进一步说明了本发明，从中可以得出更多实施方式和优点。这些实施例旨在说明本发明，但不限制其范围。