一种高保守高免疫原性抗原肽及其筛选方法和应用

本发明属于医药领域，具体涉及一种高保守高免疫原性抗原肽及其筛选方法和应用，尤其是在制备双靶向脂质体疫苗递送载体中的应用。

背景技术：

1、冠状病毒感染性疾病严重威胁人类生命健康和公共卫生安全。sars-cov、mers-cov及sars-cov-2的相继暴发，尤其是sars-cov-2的全球大流行，对社会经济和公共卫生造成重大冲击。疫苗接种是防控的关键手段，但现有疫苗多基于流行毒株的易变区域（如刺突蛋白），面对病毒的快速变异，存在广谱性不足的问题。从病毒发现至疫苗上市的时间窗口为病毒传播提供了机会，且病毒变异导致免疫逃逸，显著削弱了现有疫苗的预防效果，使得研发可预防不同变异株的广谱疫苗成为迫切需求。亚单位疫苗因安全性高、成分明确等优势成为新一代疫苗的重要发展方向。但其存在免疫原性弱、难以有效激活cd8⁺细胞毒性t淋巴细胞（ctl）介导的细胞免疫应答的核心缺陷。抗原的高效淋巴结靶向递送与胞内交叉递呈是提升其细胞免疫效力的关键。

2、现有递送系统普遍面临靶向性不足、胞内转运障碍和细胞器定位缺失三大技术瓶颈。抗原无法精准靶向树突状细胞（dc）并富集于淋巴结，被dc摄取后多数进入溶酶体降解，难以通过mhc i类分子途径进行交叉递呈，导致细胞免疫应答弱。脂质体是理想的疫苗递送载体。通过dec-205抗体修饰可提升dc摄取效率，利用可电离脂质（如dlin-mc3-dma, mc3）可实现溶酶体逃逸，利用磺酰胺类分子可实现内质网靶向。然而，现有系统多为单一功能修饰，无法整合“靶向摄取-溶酶体逃逸-内质网定位”的完整胞内递送。

3、针对病毒变异，疫苗诱导的中和活性可能大幅下降。因此，基于保守抗原表位的广谱疫苗研发策略具有可行性。但仅具备保守性并不足够，部分表位诱导的保护性有限，甚至可能引发抗体依赖增强效应（ade）。

4、因此，筛选兼具高保守性和高免疫原性且能诱导有效保护性免疫应答的抗原表位，是亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种高保守高免疫原性抗原肽及其筛选方法和应用，用于解决目前疫苗无法兼具高保守性和高免疫原性的问题。

2、本发明的第一目的在于提供一种高保守高免疫原性抗原肽，所述抗原肽的氨基酸序列如seq id no: 1所示。

3、作为本发明的优选，所述抗原肽的氨基酸序列如seq id no: 1所示，为ypkcdrampnmlrimaslvlarkht，位置为orf1ab_5011-5035，后文简称为ypk。

4、作为本发明的优选，所述高保守高免疫原性抗原肽来源于冠状病毒保守抗原表位区域，兼具较高的序列保守性和较强的免疫原性，能够诱导机体产生有效免疫应答, 具有作为广谱冠状病毒疫苗候选抗原的潜力。

5、本发明的第二目的在于提供一种所述的高保守高免疫原性抗原肽的筛选方法，包括以下步骤：

6、步骤1、获取不同冠状病毒及其变异株的全长蛋白序列，构建候选抗原表位筛选数据集；

7、步骤2、利用抗原表位集成预测工具covep，结合多种算法预测候选抗原表位筛选数据集中肽段的t细胞表位，通过多维理化参数及对应的b细胞表位预测工具评估b细胞表位，整合两类预测结果，获得候选抗原表位；

8、步骤3、对所述候选抗原表位进行保守性分析，筛选获得高保守候选表位；

9、步骤4、对高保守候选表位进行体外免疫原性评价，剔除弱免疫原性肽段，获得候选抗原肽；

10、步骤5、延长所述候选抗原肽以涵盖完整mhc ii类t细胞表位区域，结合b细胞表位评分优化其上下游序列，得到延长候选肽；

11、步骤6、对延长候选肽进行免疫原性筛选和体内免疫原性评价，确定最终的高保守高免疫原性抗原肽。

12、作为本发明的优选，步骤2包括：

13、（1）获取候选t细胞表位：利用抗原表位集成预测工具covep，整合netmhcpan 4.1、mhcflurry和deephlapan进行mhc i类t细胞表位预测；其中deephlapan binding score＞0.5、immunogenic score＞0.5，netmhcpan affinity＜500 nm且rank＜2%，mhcflurryrank＜2%；利用netmhciipan 4.0和mixmhc2pred进行mhc ii类t细胞表位预测，其中netmhciipan rank＜10%，mixmhc2pred rank＜2%；将同时符合相应预测工具筛选阈值的多肽确定为候选t细胞表位；

14、（2）获取候选b细胞表位：采用bepipred-1.0、bepipred-2.0、chou-fasman β转角预测、emini表面可及性预测、karplus-schulz柔韧性预测、kolaskar-tongaonkar抗原性预测和parker亲水性预测七种b细胞表位预测工具进行综合评价，其中bepipred-1.0评分＞0.35，bepipred-2.0评分＞0.5，emini评分＞1，chou-fasman、karplus-schulz、kolaskar-tongaonkar和parker预测结果均以高于相应平均值为筛选阈值；将至少符合四种预测工具筛选阈值的连续氨基酸区域确定为候选b细胞表位；

15、（3）整合候选表位：合并候选t细胞表位与候选b细胞表位，筛选出能同时激活细胞免疫和体液免疫应答的共同候选抗原表位，即为候选抗原表位。

16、作为本发明的优选，所述体外免疫原性评价包括抗原特异性t细胞应答水平检测、树突状细胞活化能力检测、il-12与tnf-α的分泌水平检测；所述体内免疫原性评价包括体液免疫应答水平检测和细胞免疫应答水平检测。

17、作为本发明的优选，所述筛选方法还包括：步骤7、通过假病毒中和实验检测所述高保守高免疫原性抗原肽诱导产生的针对不同冠状病毒变异株的中和抗体水平，以验证其广谱保护潜力。

18、本发明的第三目的在于提供了一种双靶向脂质体疫苗递送载体的制备方法，包括以下步骤：

19、（a）将抗原在脂质内核形成过程中同步包载于脂质内核的亲水腔中，形成负载抗原的脂质内核；以及

20、（b）在所述负载抗原的脂质内核外层依次引入可电离脂质dlin-mc3-dma和dec-205抗体-磷脂偶联物，形成淋巴结-内质网双靶向脂质体，制得负载抗原的双靶向脂质体疫苗递送载体。

21、作为本发明的优选，所述抗原为ova蛋白或氨基酸序列如seq id no：1所示的所述高保守高免疫原性抗原肽ypk。

22、作为本发明的优选，所述淋巴结-内质网双靶向脂质体，后文简称为dsm-lipo；其中负载ova模型抗原者记为ova@dsm-lipo，负载ypk抗原肽者记为ypk@dsm-lipo，未修饰脂质体记为lipo，仅含十二烷基磺酰胺修饰者记为sul-lipo，仅含mc3包覆者记为mc3-lipo，仅含dec-205抗体修饰者记为dec-lipo，同时含mc3包覆与十二烷基磺酰胺修饰者记为mc3+sul-lipo。

23、作为本发明的优选，所述双靶向脂质体疫苗递送载体由以下步骤构建：

24、（a）将抗原在脂质内核形成过程中同步包载于脂质内核的亲水腔中，形成负载抗原的脂质内核；以及

25、（b）在所述负载抗原的脂质内核外层依次引入可电离脂质dlin-mc3-dma和dec-205抗体-磷脂偶联物，形成淋巴结-内质网双靶向脂质体，制得负载抗原的双靶向脂质体疫苗递送载体；所述抗原为ova蛋白或所述高保守高免疫原性抗原肽ypk。

26、作为本发明的优选，步骤（a）中的负载抗原的脂质内核按以下方法构建：将蛋黄卵磷脂e80、胆固醇和十二烷基磺酰胺溶于无水乙醇形成油相，将抗原溶于超纯水形成水相，通过微流控技术进行组装，所得产物经透析处理，形成负载抗原的脂质内核。

27、作为本发明的优选，所述蛋黄卵磷脂e80与胆固醇的质量比为2:1。

28、作为本发明的优选，所述油相中的十二烷基磺酰胺的浓度为10 μm。

29、作为本发明的优选，步骤（b）中的淋巴结-内质网双靶向脂质体的构建包括以下步骤：

30、将可电离脂质dlin-mc3-dma溶于无水乙醇，经旋转蒸发形成脂质薄膜，以所述负载抗原的脂质内核混悬液水化所述脂质薄膜，经振荡及超声处理形成外层脂质层；以及

31、将dec-205抗体-磷脂偶联物与所得脂质体混合孵育，使所述偶联物中的磷脂链插入脂质体外层，经过滤处理后，制得淋巴结-内质网双靶向脂质体。

32、作为本发明的优选，可电离脂质dlin-mc3-dma的摩尔数占脂质总摩尔数的10%。

33、作为本发明的优选，所述超声处理在冰浴条件下采用探头式超声进行，超声功率为30 w，工作2 s、间隔3 s，每轮超声3 min，共进行2轮。

34、本发明的第四目的在于提供一种根据所述的构建方法获得的淋巴结-内质网双靶向脂质体疫苗递送载体。

35、本发明的第五目的在于提供一种所述高保守高免疫原性抗原肽在制备双靶向脂质体疫苗递送载体中的应用。

36、本发明的第六目的在于提供一种根据所述的构建方法获得的淋巴结-内质网双靶向脂质体疫苗递送载体，或者所述的淋巴结-内质网双靶向脂质体疫苗递送载体在制备用于诱导抗原特异性免疫应答的疫苗中的应用。

37、本发明的第七目的在于提供所述高保守高免疫原性抗原肽或所述双靶向脂质体疫苗递送载体在制备用于诱导针对冠状病毒的抗原特异性免疫应答的疫苗中的应用。

38、本发明所述脂质体通过不同功能组分的协同作用促进抗原递送，主要通过以下方式实现：内质网定位与溶酶体逃逸方面，经dec-205抗体介导，该脂质体可被树突状细胞高效摄取，依靠可电离脂质mc3在酸性内吞体中质子化破坏膜结构，实现高效溶酶体逃逸，同时表面修饰的十二烷基磺酰胺能引导抗原向内质网富集、定位，促进抗原的交叉递呈；在提升交叉递呈能力上，通过协同作用可使外源性抗原进入内质网中的mhc i类分子抗原加工递呈通路，提升交叉递呈效率，还能促进树突状细胞表面共刺激分子及mhc i/ii 类分子表达上调，增强抗原呈递信号强度；关于靶向富集于引流淋巴结，局部给药后该脂质体可快速进入淋巴循环并特异性富集于引流淋巴结，与普通脂质体及游离抗原相比，其富集效率显著提高，进而提高抗原利用率、降低潜在风险；在诱导免疫应答方面，它可同时激活机体适应性免疫的两大分支，诱导产生高滴度抗原特异性igg抗体以增强体液免疫应答，还能促进th1型细胞因子分泌、抑制th2型细胞因子释放，驱动cd8+ctl增殖与活化，形成以th1型为主导的强效细胞免疫应答。负载ova模型抗原后，可提高h-2kb-siinfekl复合物水平，并增强t细胞及b细胞相关免疫应答；负载ypk后，同样能够诱导抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答。

39、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

40、（1）本发明保护的高保守高免疫原性抗原肽来源于新型冠状病毒保守抗原表位区域，在新型冠状病毒及其变异株中具有较高保守性，可降低现有疫苗抗原易受病毒变异和免疫逃逸影响的问题。且该抗原肽能够诱导机体产生高效体液免疫和细胞免疫应答，具有作为广谱冠状疫苗候选抗原的应用潜力。

41、（2）本发明的筛选所述高保守高免疫原性抗原肽的方法，是通过表位集成预测、保守性分析、体外免疫原性筛选、延长设计及体内免疫原性评价相结合的方式，能够更有效地筛选获得兼具高保守性和高免疫原性的候选抗原肽。

42、(3) 本发明实现了“细胞靶向-胞内逃逸-内质网定位”协同递送，并具备优异的体内靶向分布特性。通过整合dec-205抗体介导的树突状细胞靶向、mc3介导的溶酶体逃逸及十二烷基磺酰胺介导的内质网靶向，构建完整胞内递送，使抗原高效摄取并精准进入内质网交叉递呈通路，显著减少溶酶体降解，提升抗原利用率；同时该脂质体可在体内高效富集于引流淋巴结，提高免疫效率与递送安全性。

43、(4) 本发明显著增强抗原交叉递呈效率，同步诱导强效体液免疫与th1型细胞免疫应答。所述脂质体可显著上调树突状细胞表面cd80、cd86、mhc i/ii类分子表达，强力促进外源性抗原交叉递呈，突破传统亚单位疫苗难以激活cd8+t细胞的瓶颈；并可同时诱导高滴度特异性igg抗体，以及以ifn-γ、il-12升高为特征的th1型优势免疫，显著促进cd8+细胞毒性t细胞增殖活化，对胞内病原体感染具有更强的免疫保护效果。