一种检测非酒精性脂肪肝PNPLA3基因rs738409C>G突变的方法、组合物及试剂盒

本发明属于分子诊断，具体涉及一种检测非酒精性脂肪肝pnpla3基因rs738409c>g突变的方法、组合物及试剂盒。

背景技术：

1、代谢相关脂肪性肝病（masld），原称非酒精性脂肪性肝病（nafld），是我国高发的慢性代谢性肝脏疾病，疾病谱涵盖单纯肝脂肪变性、代谢相关脂肪性肝炎（mash，原称非酒精性脂肪性肝炎nash），并可进一步进展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌。pnpla3基因（patatin-like phospholipase domain-containing 3，又称adiponutrin）位于人类第22号染色体长臂13带3亚带（22q13.31），其编码蛋白具有甘油三酯水解酶活性，在肝细胞脂质代谢中发挥关键作用。

2、pnpla3基因rs738409（c>g，c.444c>g）是目前公认的与非酒精性脂肪肝发病风险高度相关的遗传易感位点。该c>g单碱基变异使编码蛋白第148位异亮氨酸（ile，密码子atc）突变为甲硫氨酸（met，密码子atg），即p.i148m。突变后pnpla3蛋白的脂解活性显著下降，肝细胞内甘油三酯水解受阻、脂质异常蓄积，显著提升个体发生masld、mash及肝纤维化的遗传易感风险。该位点存在野生纯合cc、杂合cg、突变型纯合gg三种基因型，其中，携带g等位基因的个体masld发病风险显著升高，且g等位基因剂量与疾病严重程度呈正相关。

3、现有pnpla3 rs738409位点的基因分型手段主要包括sanger测序、taqman探针法和二代测序（ngs）。sanger测序对低比例嵌合或低丰度突变样本检出能力有限，可靠检出下限约为15～20%等位基因频率；taqman探针法试剂成本较高，对仪器设备有一定要求；ngs测序依赖大型测序平台，检测周期长、成本高。上述方法对设备和操作人员技术水平要求较高，不利于基层医疗机构开展大规模人群遗传风险筛查。此外，对于嵌合体样本或循环游离dna（ctdna）等存在低丰度g等位基因的样本，传统方法容易出现漏检。

4、crispr-cas系统中的fncas12a（来源于francisella tularensis subsp.novicida u112）具备独特的旁侧切割活性：当crrna引导fncas12a特异性识别并结合双链靶dna后，可激活其非特异性单链dna酶切活性，切碎体系中任意单链dna荧光淬灭探针，释放可被荧光读取仪检测的荧光信号。该检测为等温反应，无需热循环仪和测序仪，适合开发快速分子诊断工具。然而，目前尚无针对pnpla3 rs738409位点经过体系优化的特异性crrna及配套荧光淬灭探针，也缺乏针对该位点低丰度等位基因的高灵敏度检测方案。因此，临床亟需一种快速、操作简便、灵敏度高、设备门槛低的pnpla3 rs738409突变检测方法，用于masld人群遗传易感风险的辅助筛查。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种检测非酒精性脂肪肝pnpla3基因rs738409c>g突变的方法、组合物及试剂盒，解决现有检测手段耗时长、低丰度等位基因灵敏度不足、依赖昂贵设备的技术痛点，填补缺少针对rs738409c>g位点专用fncas12a-crrna与匹配探针的技术空白。

2、第一方面，一种检测非酒精性脂肪肝pnpla3基因rs738409c>g突变的方法，包括如下步骤：

3、s1、获取待测样本，并提取待测样本的基因组dna；

4、s2、以基因组dna为模板，使用pcr引物对扩增包含rs738409c>g突变位点的目标区域，获得扩增产物；

5、s3、将扩增产物、fncas12a蛋白、crrna和荧光淬灭探针混合，进行fncas12a切割反应，获得酶切产物，其中，crrna包含支架序列和间隔序列，间隔序列与包含rs738409c>g突变位点的目标核酸序列的靶链互补配对；

6、s4、对酶切产物进行荧光信号检测，根据终点荧光信号相对于空白对照的增加倍数，判定待测样本是否存在rs738409c>g突变。

7、优选的，在步骤s1中，所述待测样本为外周静脉血或口腔拭子，其中，外周静脉血采用edta抗凝管采集，口腔拭子采集时擦拭双侧颊黏膜10～15次。

8、优选的，在步骤s2中，所述pcr引物对的上游引物序列如seq id no:2所示，下游引物序列如seq id no:3所示；

9、pcr扩增程序为：95℃，10min；35个循环（94℃，15s，56℃，15s，72℃，30s）；72℃，20min；10℃，hold；

10、pcr扩增产物长度为291bp，完整覆盖rs738409c>g突变位点、pam序列5'-ttca-3'及crrna识别区域；

11、pcr试剂采用amplitaq gold 360 mastermix。

12、优选的，在步骤s3中，所述fncas12a蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示；

13、crrna的支架序列如seq id no:4所示，crrna的间隔序列如 seq id no:5所示，间隔序列用于特异性识别包含rs738409c>g突变位点的目标核酸序列；

14、所述目标核酸序列为目标双链dna，目标双链dna为包含pnpla3基因rs738409c>g突变位点的核酸片段，目标双链dna的靶链与crrna的间隔序列互补配对；rs738409的g突变碱基位于非靶链，对应crrna间隔序列5'端第2位核苷酸，且位于间隔序列靠近pam序列端的种子序列区域内，种子序列区域为间隔序列5'端靠近pam序列的1～6个连续核苷酸区域，其中，目标双链dna的靶链如seq id no:6所示，非靶链如seq id no:7所示，pam序列为5'-ttca-3'；

15、所述荧光淬灭探针包含荧光基团fam和淬灭基团bhq1，其核酸序列如seq id no:8所示；

16、所述fncas12a切割反应体系为20μl，其中，fncas12a蛋白的终浓度为80nm，crrna的终浓度为100nm，荧光淬灭探针的终浓度为400nm，pcr扩增产物的浓度为1～5ng/μl，反应缓冲液为1×，rnase抑制剂的终浓度为0.8u/μl，反应条件为37℃孵育15min。

17、优选的，在步骤s4中，荧光信号检测的激发波长为485nm，发射波长为520nm；空白对照为无模板空白对照，且以当次实验无模板空白对照的实测rfu值作为分母计算增加倍数；

18、判定标准为：

19、初次检测时，当待测样本终点荧光信号相对于空白对照的增加倍数小于10倍时，判定为阴性；当待测样本终点荧光信号相对于空白对照增加倍数≥10倍且<50倍，判定为灰区，需重新取样复测；当待测样本终点荧光信号相对于空白对照增加倍数为50～400倍时，判定为弱阳性，并对弱阳性样本进行二次pcr扩增确认；当待测样本终点荧光信号相对于空白对照增加倍数大于400倍时，判定为阳性；

20、灰区的待测样本复测时，若复测结果仍小于50倍，判定为阴性；若复测结果为50～400倍，判定为弱阳性，并对弱阳性样本进行二次pcr扩增确认；若复测结果大于400倍，判定为阳性。

21、更优选的，弱阳性样本进行二次pcr扩增确认的操作如下：取初次pcr扩增产物进行二次pcr扩增，二次pcr扩增所用引物和程序与步骤s2相同，二次扩增产物再次进行fncas12a切割反应，若二次扩增终点荧光信号相对于空白对照的增加倍数大于400倍，判定为阳性，否则判定为阴性，二次pcr扩增后的结果作为最终判定。

22、第二方面，本发明还提供了一种检测非酒精性脂肪肝pnpla3基因rs738409c>g突变的组合物，包括fncas12a蛋白、crrna和荧光淬灭探针；

23、所述fncas12a蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示；

24、所述crrna包含支架序列和与支架序列3'端连接的间隔序列，间隔序列如seq idno:5所示，支架序列如seq id no:4所示；

25、所述荧光淬灭探针包含荧光基团fam和淬灭基团bhq1，其核酸序列如seq id no:8所示。

26、第三方面，本发明还提供了一种检测非酒精性脂肪肝pnpla3基因rs738409c>g突变的试剂盒，包括上述的一种检测非酒精性脂肪肝pnpla3基因rs738409c>g突变的组合物，以及用于扩增含rs738409c>g位点目标区域的pcr引物对；

27、所述pcr引物对的上游引物序列如seq id no:2所示，下游引物序列如seq id no:3所示；

28、试剂盒还包含野生型对照品和突变型对照品，野生型对照品含有pnpla3基因rs738409野生型序列片段，突变型对照品含有rs738409c>g突变位点的pnpla3基因片段；

29、试剂盒还包含反应缓冲液和rnase抑制剂。

30、优选的，所述野生型对照品和突变型对照品除rs738409c>g突变位点外其余序列相同，野生型对照品的序列片段如seq id no:9所示，突变型对照品的序列片段如seq idno:10所示；野生型对照品和突变型对照品分别独立包装。

31、第四方面，本发明还提供了上述的一种检测非酒精性脂肪肝pnpla3基因rs738409c>g突变的组合物、或上述的一种检测非酒精性脂肪肝pnpla3基因rs738409c>g突变的试剂盒，在制备用于辅助评估非酒精性脂肪肝遗传易感风险的产品中的用途。

32、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

33、1、本发明首次针对rs738409c>g突变位点设计fncas12a特异性crrna，将rs738409突变碱基布置于crrna间隔序列5'端种子区第2位，利用种子区单碱基错配显著抑制fncas12a激活的特性，实现突变g等位基因与野生c等位基因的高效区分，cas12a识别双链靶dna遵循“种子区初始配对—r-loop逐步延伸”的动力学过程，种子区内的单碱基错配会显著降低r-loop的形成速率与稳定性，从而抑制cas12a的激活及其非特异性单链dna旁侧切割活性。因此，当rs738409为野生型c等位基因时，crrna间隔序列5'端第2位g与靶链对应位置构成g-g错配，fncas12a激活受到显著抑制，荧光信号维持低水平；而当rs738409为突变型g等位基因时，该位置构成g-c完全配对，fncas12a被有效激活，实现对单碱基差异的区分，这提供了一种针对该位点的crispr-cas12a检测方案。

34、2、本发明的核心扩增与检测流程时长小于1.5h；pcr预扩增后，fncas12a切割为37℃等温反应，无需测序仪和热循环仪；pcr预扩增仍需常规pcr仪，初步验证特异性良好；单次检测灵敏度达1%等位基因频率，二次pcr后可达0.1%，适合基层开展masld遗传易感风险辅助筛查。

35、3、本发明的检测样本来源便捷，可采用外周静脉血或口腔拭子；设置灰区重复检测和弱阳性二次pcr复测两级质控流程，有助于降低假阳性和假阴性风险。