一种β-甘露聚糖酶突变体、基因及其用途的制作方法

本发明酶工程与饲料添加剂，具体涉及一种β-甘露聚糖酶突变体、编码基因及其用途。

背景技术：

1、β-甘露聚糖酶是饲料工业核心的抗营养因子降解酶，可专一性水解植物原料中β-1,4-甘露聚糖糖苷键，分解大分子甘露聚糖为可被动物吸收的小分子还原糖。在畜禽、水产规模化养殖中，玉米-豆粕型主流饲料富含大量水溶性甘露聚糖，该类多糖无法由动物自身消化酶降解，是饲料中最主要的抗营养因子之一。其大量存在会显著升高动物肠道食糜黏度，阻碍肠道上皮细胞对蛋白质、氨基酸、淀粉及矿物质的跨膜吸收，直接导致饲料转化率下降、动物生长迟缓；同时，高黏度肠道内容物会减缓食糜排空速度，滋生大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌，破坏肠道菌群稳态，损伤肠道黏膜屏障功能，降低动物机体抗病能力，大幅提升养殖损耗与生产成本。

2、现阶段商业化饲料用β-甘露聚糖酶多为天然野生型微生物源酶，普遍存在固有性能缺陷，难以适配现代化饲料加工与养殖应用场景。一方面，野生型β-甘露聚糖酶催化活性偏低，单位酶活降解效率有限，饲料添加剂量大、应用成本高；另一方面，野生型酶结构稳定性差，仅可在常温、中性偏酸狭小区间保持活性，饲料生产过程中75～85℃的高温调质、制粒、膨化工序会造成其蛋白构象快速坍塌、酶活大幅流失，加工后有效活性残留率极低。同时，野生型酶无法耐受畜禽胃部强酸性环境与饲料加工酸碱波动环境，进入动物胃肠道后易失活，实际饲喂增效效果不稳定，严重制约了β-甘露聚糖酶在高端绿色饲料添加剂领域的规模化、产业化应用。定点分子突变是实现酶学性质定向改良的核心技术，可精准优化酶分子结构与催化性能，是突破野生型酶应用瓶颈的关键技术手段。

3、现有研究多集中于单一位点突变改造，存在性能提升单一、稳定性改良效果有限的问题，无法同时兼顾酶活、耐热性与酸碱耐受性。基于此，本发明通过精准生物信息学分析，筛选出影响野生型β-甘露聚糖酶催化效率与结构稳定性的关键功能位点，创新性采用位点协同突变策略，同时结合毕赤酵母专属密码子优化与同源整合表达体系改造，从多维度实现酶性能的全面升级，有效解决了现有技术的缺陷。

技术实现思路

1、基于以上现有技术中存在的技术问题，本发明的技术方案是这样实现的：

2、本发明提供一种β-甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体为seq id no:1所示野生型β-甘露聚糖酶经定点氨基酸突变得到；所述定点突变为l23a、e120q、w181f。

3、进一步地，所述β-甘露聚糖酶突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。

4、本发明还提供编码所述β-甘露聚糖酶突变体的基因。

5、进一步地，所述基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。

6、本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述的基因序列。

7、进一步地，所述重组表达载体以ppic9k为骨架载体。

8、本发明还提供一种重组工程菌株，其特征在于，所述重组工程菌株包含所述的重组表达载体。

9、进一步地，所述重组工程菌株的宿主为毕赤酵母gs115。

10、本发明还提供所述β-甘露聚糖酶突变体在制备饲料添加剂中的应用。

11、进一步地，所述饲料添加剂适用于畜禽、水产养殖饲料的抗营养因子降解改良。

12、本发明还提供 一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包含所述的β-甘露聚糖酶突变体。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

14、本发明采用三位点协同突变的创新改造策略，l23a突变优化底物结合口袋空间结构、提升底物亲和性，e120q突变优化活性中心催化微环境、降低反应能垒，w181f突变强化蛋白内部疏水作用、提升结构刚性，三位点协同作用使突变体m1比酶活较野生型酶提升59.9%，催化效率实现质的突破；同时彻底解决野生型酶高温易失活缺陷，85℃极端高温处理后仍保留65.3%的高活性，可完全耐受饲料工业化高温制粒、膨化工艺，加工稳定性大幅提升；显著拓宽酸碱稳定区间，在ph2.0强酸性至ph7.0中性环境中均可保持85%以上残余酶活，完美适配饲料加工酸碱波动及畜禽、水产动物胃肠道生理环境。本发明突变体m1可有效降解饲料抗营养因子、优化肠道微生态、提升饲料利用率与动物生长性能，性能全面优于现有野生型酶，稳定性、适用性与经济性优势突出，产业化推广价值极高。

1.一种β-甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体为seq id no:1所示野生型β-甘露聚糖酶经定点氨基酸突变得到；所述定点突变为l23a、e120q、w181f；所述β-甘露聚糖酶突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。

2.编码权利要求1所述β-甘露聚糖酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2-3任一项所述的基因序列。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以ppic9k为骨架载体。

6.一种重组工程菌株，其特征在于，所述重组工程菌株包含权利要求4-5任一项所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组工程菌株，其特征在于，所述重组工程菌株的宿主为毕赤酵母gs115。

8.权利要求1所述β-甘露聚糖酶突变体、权利要求2-3任一项所述的基因、权利要求4-5任一项所述的重组表达载体或权利要求6-7任一项所述的重组工程菌在制备饲料添加剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂适用于畜禽、水产养殖饲料的抗营养因子降解改良。

10.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包含权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体。