一种基于CRISPR/Cas12a驱动及AND逻辑门控的双miRNA检测方法

本发明属于纳米功能材料制备与生物传感分析，具体涉及一种基于crispr/cas12a驱动及and逻辑门控的双mirna检测方法。

背景技术：

1、有机光电化学晶体管(opect)技术是一种结合了光电化学(pec)免疫传感技术和有机电化学晶体管(oect)的分析方法。其利用有机半导体材料并结合光电化学原理的晶体管，能够将光信号转换为电信号并进行放大，使得痕量的信息也得以被放大进行检测。在典型的耗尽型opect中，以pedot：pss为导电聚合物通道，光在栅极/电解质（g/e）界面处引起的电位变化可以调节通道的掺杂/脱掺杂状态，导致通道/电解质（c/e）界面处的电位变化，从而实现放大沟道电流的信号的目的。opect检测已经被证实在多种肿瘤标志物中具有较高的灵敏度和较低的检测限。除此以外，有机光电化学晶体管技术应用广泛，已被成功应用于多种领域，包括生物分析、环境监测、疾病诊断等。它在生物医学和环境科学等领域展现出巨大的潜力。随着科学技术的不断进步，未来有机光电化学晶体管技术有望在更多领域发挥重要作用。

2、然而，上述现有的opect生物传感技术方案在实际应用于生物样本检测时，仍存在以下显著的缺陷和不足：首先，现有的opect传感器大多针对单一分析物进行设计，在面对成分复杂的真实生物样本时，极易因非特异性吸附或单一干扰物而产生假阳性信号，导致诊断可靠性受限；其次，尽管opect技术固有的信号放大能力为生物检测提供了基础，但其检测灵敏度仍存在瓶颈：对于体液中丰度极低的痕量生物标志物，传统opect传感器往往因缺乏高效的级联信号放大策略而导致信噪比不足，难以实现准确、稳定的定量检测，从而无法满足临床早期筛查对超高灵敏度的严苛需求。

技术实现思路

1、基于上述技术问题，本发明提出一种基于crispr/cas12a驱动及and逻辑门控的双mirna检测方法。该方法通过构建and逻辑门机制，实现了对mirna-122和mirna-21的高灵敏同步联合检测。

2、本发明所采用的技术解决方案是：

3、一种基于crispr/cas12a驱动及and逻辑门控的双mirna检测方法，包括以下步骤：

4、（1）先分别制备cu2-xs/mcs光敏复合材料和mn3o4nps纳米酶；随后采用mn3o4nps纳米酶对信号探针进行修饰，并将其固定在cu2-xs/mcs光敏复合材料表面，制备光电极；

5、（2）将待测样品与h1、h2混合，得到含有h1、h2的混合液，将其滴加至步骤（1）制备的光电极表面，进行第一次孵育；同时，将另一份所述待测样品与h3、h4混合，得到含有h3、h4的混合液，将其放置在容器中，进行第二次孵育，并得到二次孵育溶液；

6、（3）将cas12a/crrna复合物溶液和步骤（2）得到的二次孵育溶液加入tmbs缓冲溶液中混合均匀，随后滴加至经步骤（2）处理后的光电极表面并进行反应，反应结束后，用pbs冲洗该光电极；

7、（4）在步骤（3）处理后的光电极表面滴加4-cn溶液和h2o2溶液并进行第三次孵育，孵育结束后，用pbs冲洗该光电极；随后将该光电极接入有机光电化学晶体管系统进行信号检测；

8、（5）若上述待测样品中同时包含mirna-122和mirna-21，则能够检测到光电信号。

9、优选的，步骤（1）中所述cu2-xs/mcs光敏复合材料的制备方法包括以下步骤：将mn(ch3coo)2·4h2o和cd(ch3coo)2·2h2o溶解在去离子水中，随后加入taa溶液得到混合液；向混合液中加入cu2-xs固体粉末，搅拌均匀后转移至反应釜中，160~200℃下反应22~26小时，制得cu2-xs/mcs光敏复合材料。

10、优选的，步骤（1）中：所述mn(ch3coo)2·4h2o和cd(ch3coo)2·2h2o用量的摩尔比为0.5~0.7：1.2~1.6，所述cu2-xs固体粉末的加入量为反应体系总质量的10~12%。

11、优选的，步骤（1）中所述mn3o4nps纳米酶的制备方法包括以下步骤：将mn3o4nps纳米颗粒分散在二水合柠檬酸钠溶液中，60~80℃下搅拌3~5小时后离心收集沉淀，并将该沉淀分散至mes缓冲溶液中，随后加入edc和nhs在3~5℃下进行孵育；孵育完成后离心收集沉淀，并将该沉淀分散至pbs中，随后加入sa溶液在3~5℃下进行孵育，孵育完成后离心收集沉淀，制得mn3o4nps纳米酶。

12、优选的，步骤（1）中所述光电极的制备方法具体包括以下步骤：将 c1和 s1溶解于tmbs 缓冲溶液中，变性、孵育后生成双链 dna；将cu2-xs/mn0.3cd0.7s 悬浮液滴加在 ito 电极上，随后干燥并加入2-巯基乙酸溶液进行反应；反应结束后，用含有 edc和 nhs的混合溶液进行活化，随后用pbs 缓冲液洗涤，滴加上述制备的双链 dna并进行孵育；孵育完成后加入bsa 溶液再次进行孵育后封板，随后用pbs 洗涤电极；最后，将洗涤后的电极浸入mn3o4nps纳米酶溶液中，实现mn3o4nps纳米酶对双链 dna信号探针的修饰，制得光电极。

13、优选的，步骤（2）中：所述含有h1、h2的混合液中h1、h2的浓度均为0.8~1.2μm；所述第一次孵育的温度为20~30℃，时间为60~80min。

14、优选的，步骤（2）中：所述含有h3、h4的混合液中h3、h4的浓度均为0.8~1.2μm；所述第二次孵育的温度为20~30℃，时间为60~80min。

15、优选的，步骤（3）中：所述cas12a/crrna复合物溶液中cas12a、crrna的浓度均为45~55nm；所述反应的温度为30~40℃，时间为60~70min。

16、优选的，步骤（4）中：所述4-cn溶液和h2o2溶液的浓度均为0.8~1.2 mm，二者用量的体积比为0.8~1.2：0.8~1.2；所述第三次孵育的温度为10~30℃，时间为20~40min。

17、优选的，若所述待测样品包含mirna-122，则步骤（2）中将进行由mirna-122触发的cha i反应，生成h1/h2双链并通过粘性末端介导的链置换反应，使固定在cu2-xs/mcs光敏复合材料表面的信号探针由双链结构转化为单链结构；若所述待测样品包含mirna-21，则步骤（2）中将进行由mirna-21触发的cha ii反应，生成h3/h4双链以激活步骤（3）中的cas12a；若所述待测样品中同时包含mirna-122和mirna-21，则cha i反应和cha ii反应同时进行，在步骤（3）中被激活的cas12a通过反式切割作用剪切光电极表面的单链结构信号探针，使mn3o4nps纳米酶脱落，最终能够检测到光电信号。

18、本发明的有益技术效果如下：

19、本发明的opect作为新兴的检测方法，结合了oect的放大效应、良好的生物兼容性和pec的高灵敏度、快速响应等优良特性，在生物分析检测中展示出了优异的发展前景。并且结合cu2-xs/mn0.3cd0.7s光敏材料、cha扩增、催化沉淀等手段灵活地对pedot：pss通道进行门控，最终在零栅偏压下实现最大的沟道电流变化。该生物传感器检测范围更宽，检测线更低，有望应用于临床检测中。此外，该策略提供了一个通用、可扩展的平台，通过更换适配体识别元件，可将其拓展至广泛的分析物检测，为新一代opect适配体传感器的开发开辟了新途径。