培养基及制备方法、应用、中华被毛孢芽生孢子制备方法与流程

本发明涉及中华被毛孢培养，具体而言，涉及一种中华被毛孢的培养基、制备方法及应用、中华被毛孢芽生孢子制备方法。

背景技术：

1、冬虫夏草是我国珍稀名贵中药材，中华被毛孢（hirsutella sinensis）是冬虫夏草菌无性阶段的主要侵染菌株，其菌丝体所含有效成分与天然冬虫夏草基本接近，被视为替代野生资源的有效途径之一。

2、然而，现有中华被毛孢的人工培养技术仍存在以下不足：菌种经多代繁育后易出现种性退化，活性降低；培养过程中杂菌污染风险高，菌种纯度难以保证；芽生孢子浓度和收率偏低，难以满足工厂化生产对高浓度、高活性菌种的需求。

3、因此，如何通过培养基配方与制备工艺的优化，在缩短培养周期的同时获得高纯度、高浓度的中华被毛孢芽生孢子，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术或相关技术中存在的技术问题之一。

2、为此，本发明的第一方面提出一种中华被毛孢的培养基，培养基以质量百分数计，包括以下组分：

3、琼脂1.5%～2.5%、豆粉0.2%～0.5%、牛肉膏0.5%～1.5%、蛋白胨0.5%～1.0%、乳蛋白0.5%～1.5%和大蜡螟虫浸出液0.3%～0.8%，余量为水。

4、本发明的第二方面提出一种中华被毛孢的培养基的制备方法，包括：将活体大蜡螟虫置于环境温度为零下30-50℃的环境中冷冻；将冷冻后的大蜡螟虫研磨成粉末；将粉末溶于无菌水中，得到大蜡螟虫粉末溶液；将大蜡螟虫粉末溶液经孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到大蜡螟虫浸出液；将琼脂粉、豆粉、牛肉膏、蛋白胨、乳蛋白和大蜡螟虫浸出液按配比称取，溶于水中，得到混合液；将混合液的ph值调节至5～7，对混合液进行灭菌，得到膏体的培养基。

5、在本发明的一些技术方案中，可选地，执行对混合液进行灭菌时，将灭菌的温度控制在115-125℃，灭菌15-25分钟。

6、本发明的第三方面提出了一种中华被毛孢的培养基的应用，培养基为第一方面的中华被毛孢培养基，培养基用于制备中华被毛孢芽生孢子。

7、本发明的第四方面提出了一种中华被毛孢芽生孢子的制备方法，培养基用于制备中华被毛孢芽生孢子的方法包括：将中华被毛孢菌株接种于如第一方面的中华被毛孢的培养基上进行膏体培养，得到活化菌株；将活化菌株转接至液体培养基中进行液体培养，得到液体菌种；将液体菌种经2600目细胞筛过滤，收集滤液；将滤液进行分阶段离心，沉淀，得到中华被毛孢芽生孢子。

8、在本发明的一些技术方案中，可选地，液体培养基以质量百分数计，包括以下组分：

9、蛋白胨1.5%～2.5%、乳蛋白2%～4%、磷酸氢二钾0.5%～1.5%、牛肉膏2%～4%、葡萄糖2%～4%、硫酸镁1%～2%和维生素b1 0.25%～0.75%，余量为水。

10、在本发明的一些技术方案中，可选地，执行进行膏体培养时，将培养温度控制在8-12℃，培养时长为20天。

11、在本发明的一些技术方案中，可选地，执行进行液体培养时，将培养温度控制在12-16℃，并进行摇床操作，摇床转速为130-150r/min，培养时长为30天。

12、在本发明的一些技术方案中，可选地，将滤液进行分阶段离心，包括：第一阶段离心中转速控制在2800-3200r/min，离心时长为18-22分钟；第一阶段离心中转速控制在11000-13000r/min，离心时长为18-22分钟。

13、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

14、1、本发明提供的膏体培养基中含有大蜡螟虫浸出液，大蜡螟虫浸出液内的氨基酸及甾醇类物质模拟了中华被毛孢在天然宿主昆虫体内的生长环境，能够有效促进菌株活化与菌丝体增殖，菌丝干重较现有技术提高90%以上。

15、2、本发明提供的液体培养基以葡萄糖为碳源，以蛋白胨、乳蛋白和牛肉膏为复合氮源，以维生素b1为生长因子，配合磷酸氢二钾和硫酸镁提供无机营养，各组分合理配比，并配合分级过滤制备工艺，有效降低了杂菌污染风险，污染率降至1‰以下，保证了菌种纯度。

16、3、本发明通过“膏体活化培养→液体发酵培养→细胞筛过滤→分段离心”的完整工艺路线，获得的中华被毛孢芽生孢子浓度可达1×107个/ml以上，孢子活性高，完全满足工厂化生产对高浓度、高活性菌种的需求。

17、4、本发明的制备方法操作简便、周期可控，膏体培养仅需20天、液体培养仅需30天即可获得高浓度芽生孢子，相较于传统方法显著缩短了生产周期，降低了生产成本。

18、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

1.一种中华被毛孢的培养基，其特征在于，所述培养基以质量百分数计，包括以下组分：

2.一种如权利要求1所述的中华被毛孢的培养基的制备方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的中华被毛孢的培养基的制备方法，其特征在于，执行所述对所述混合液进行灭菌时，将灭菌的温度控制在115-125℃，灭菌15-25分钟。

4.一种中华被毛孢的培养基的应用，其特征在于，所述培养基为权利要求1所述的中华被毛孢培养基，所述培养基用于制备中华被毛孢芽生孢子。

5.一种中华被毛孢芽生孢子的制备方法，其特征在于，所述培养基用于制备中华被毛孢芽生孢子的方法包括：

6.根据权利要求5所述的中华被毛孢芽生孢子的制备方法，其特征在于，

7.根据权利要求5所述的中华被毛孢芽生孢子的制备方法，其特征在于，执行所述进行膏体培养时，将培养温度控制在8-12℃，培养时长为20天。

8.根据权利要求5所述的中华被毛孢芽生孢子的制备方法，其特征在于，执行所述进行液体培养时，将培养温度控制在12-16℃，并进行摇床操作，摇床转速为130-150r/min，培养时长为30天。

9.根据权利要求5所述的中华被毛孢芽生孢子的制备方法，其特征在于，所述将所述滤液进行分阶段离心，包括：