稳定构象的基于HSV-2糖蛋白B的mRNA疫苗及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，尤其涉及稳定构象的基于hsv-2 糖蛋白b的mrna疫苗及其应用。

背景技术：

1、单纯疱疹病毒2型（hsv-2）属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，为双链dna病毒，其基因组长度约为152 kb，可编码70多种蛋白。hsv-2主要通过性接触传播，是引起生殖器疱疹的主要病原体。感染后，病毒具有高度嗜神经性，可沿感觉神经纤维逆行至骶神经节，并在此建立终身潜伏感染。当机体免疫力下降（如发热、疲劳、精神压力或免疫抑制）时，潜伏的病毒可被激活，沿神经轴突下行至皮肤黏膜表面，导致疱疹反复发作。尽管目前有阿昔洛韦（acyclovir）等核苷类似物抗病毒药物可用于治疗和抑制复发，但这些药物无法彻底清除潜伏在神经节内的病毒，且长期使用可能面临耐药性问题，因此研发安全有效的预防性疫苗是控制hsv-2传播和感染的关键。

2、在hsv-2的疫苗研发中，病毒包膜糖蛋白是诱导保护性免疫应答的关键靶点。hsv-2 的包膜表面存在多种糖蛋白，其中糖蛋白b（gb）是hsv-2病毒包膜上含量最丰富、高度保守的糖蛋白之一，在病毒入侵宿主细胞的过程中发挥核心作用，其介导病毒进入宿主细胞结合与膜融合，是诱导机体产生中和抗体的核心抗原靶点。在hsv-2病毒感染过程中，gb蛋白经历从融合前构象到融合后构象的不可逆转变，是hsv-2病毒入侵宿主细胞并完成膜融合的关键步骤。gb蛋白能够诱导机体产生中和抗体和t细胞免疫应答，是理想的疫苗抗原候选物。

3、然而，利用传统方法（如减毒活疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗）或直接使用原始gb序列制备mrna疫苗时，面临若干关键挑战。首先，传统的重组gb蛋白或由原始序列表达的gb蛋白往往倾向于呈现热力学上更稳定的融合后构象，而这种构象可能隐藏或改变了融合前构象中关键的病毒中和表位，导致诱导的中和抗体效价有限。其次，直接使用原始gb序列的mrna疫苗在诱导持久、高效的免疫记忆方面仍有提升空间，尤其是在诱导黏膜免疫和抑制潜伏感染方面，现有的gb疫苗方案保护效力尚不理想。此外，部分基于原始gb蛋白的疫苗策略，在动物攻毒模型中未能提供充分的保护，甚至可能出现免疫病理反应或保护不完全的情况，导致动物死亡或出现严重临床症状。因此，现有技术亟需一种能够将gb蛋白稳定在融合前构象，并有效提升其免疫原性和保护效力的新型疫苗设计策略。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供稳定构象的基于hsv-2 糖蛋白b的mrna疫苗及其应用。

2、本发明提供了hsv-2 糖蛋白b变体，其氨基酸序列如seq id no:2所示。

3、本发明通过对gb蛋白的原始序列进行定点突变、修饰和重组，获得一系列的变体和修饰体，然后经过筛选，获得在表达后更有利于稳定暴露中和表位的融合前构象突变蛋白，其具有低细胞毒性（高生物安全性），并且具有显著提高的免疫原性和保护效力。

4、本发明提供了编码所述的hsv-2 糖蛋白b变体的核酸。

5、本发明所述的核酸可以是dna、rna。所述dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。所述dna可以是单链的或是双链的。具体而言，dna既可以以仅含一条核苷酸链的单链形式存在，也可以以通过碱基互补配对形成的双链螺旋结构存在。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列（例如启动子或转录终止子）。其中，编码区负责携带并指导目标蛋白合成的遗传信息，非编码区虽不直接编码蛋白，但可通过启动子、增强子、转录终止子等调控序列对基因的表达水平、表达时序和转录效率进行精密调节，从而优化目标抗原在宿主细胞中的表达效果。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。线性核酸通常适用于体外转录、pcr扩增及某些瞬时表达体系，环状核酸则因其相对稳定的空间结构，更有利于在细胞内维持完整性和持续进行转录表达。核酸可以是载体（如表达或克隆载体）的一部分，或一个片段。当核酸作为载体的一部分时，可借助载体所携带的复制起点、筛选标记及调控元件等功能结构，在宿主体系中实现高效扩增和稳定表达；而当核酸以片段形式存在时，可通过体外连接、重组或转染等方式进入目标体系，作为后续构建或改造的基础元件。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。天然来源的核酸能够保留原始生物学背景中的序列信息，而采用重组、酶法或化学辅助制备则可在体外对序列进行定位改造和规模化合成，有利于获得结构明确、纯度较高的核酸产物。所述rna形式为由基因转录获得的mrna等。mrna作为基因信息向蛋白转化的直接模板，能够在进入细胞后利用宿主翻译体系迅速启动蛋白合成，因而在疫苗递送和蛋白表达研究中具有重要作用。

6、进一步的，本发明所述的核酸既可以是经过优化的，也可以是未经过优化的。所述核酸优化并非对氨基酸序列本身进行改变，而是在维持所编码蛋白氨基酸序列不变的前提下，对核酸序列自身的组成与结构特征进行调整，以提升其在特定表达体系中的转录效率、翻译效率及整体稳定性。所述优化包括但不限于以下方面：对密码子使用偏好性进行调整，使核酸的密码子分布与目标宿主细胞中高丰度转运rna的偏好相匹配，从而加快翻译延伸速度并提高蛋白表达量；消除不利于基因表达的二级结构，例如发夹结构等，这类结构可能在转录或翻译过程中阻碍聚合酶或核糖体的顺利推进，进而降低表达效率；改变核酸序列中的gc含量，使整体gc比例处于适合目标宿主表达系统的范围内，以兼顾序列稳定性与转录、翻译的顺畅进行；调整cpg二核苷酸的含量，从而在必要时调节核酸的免疫刺激特性，或在特定表达体系中规避因cpg甲基化引发的表达抑制；优化mrna的二级结构，降低5’非翻译区和编码区起始部位过于稳定的结构对翻译起始造成的不利影响；去除rna不稳定区，延长成熟mrna在细胞内的半衰期，从而增加蛋白表达的持续时间。通过对上述一个或多个方面进行优化，能够使所述核酸在目标宿主体系中的表达水平、产物稳定性及操作便利性得到明显改善。

7、进一步的，所述核酸包括编码所述hsv-2 糖蛋白b的dna和/或mrna；所述mrna 的cds区的核苷酸序列如seq id no：3所示。所述mrna还包括：5′ utr、3′ utr和polya。

8、更进一步的，所述mrna的核苷酸序列如seq id no:4所示。

9、在本发明的具体实施例中，所述mrna还包括5′ 端cap 1结构。

10、本发明提供了含有所述核酸中所述mrna和药学上可接受的递送载体的制剂。

11、进一步的，所述药学上可接受的递送载体包括：脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、细胞外囊泡和/或脂质-聚合物杂合纳米颗粒。

12、所述药学上可接受的递送载体是指能够在体内递送过程中保护所述mrna免于过快降解，并促进其有效进入目标细胞、释放至胞内适当位置以完成后续翻译表达的一类载体材料。其中，脂质纳米颗粒是由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇及聚乙二醇化脂质等成分组装形成的纳米尺度颗粒，具有较高的包封效率和良好的细胞内递送能力；聚合物纳米颗粒则由可生物降解的天然或合成高分子材料构成，可通过调节聚合物组成与结构控制核酸的释放行为；细胞外囊泡是由细胞分泌的具有脂质双层膜结构的天然纳米囊泡，因其来源天然而具备较好的生物相容性和低免疫原性特点；脂质-聚合物杂合纳米颗粒则结合了脂质成分与聚合物成分的双重优势，兼顾结构稳定性和递送效率。上述递送载体既可以单独使用一种，也可以将多种类型联合使用。在本发明的具体实施例中，所述核酸递送纳米材料为脂质纳米颗粒。选择脂质纳米颗粒作为递送载体，有利于实现对所述mrna的有效包载、稳定递送和细胞内高效释放，从而保障其在目标机体中充分发挥预期的抗原表达功能。

13、进一步的，所述制剂还包括缓冲液，所述缓冲液用于在制剂制备、储存及使用过程中维持体系ph值的相对稳定，避免因ph波动对所述mrna及其递送载体的结构完整性和功能活性产生不利影响。在优选的实施方案中，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液（tris），tris缓冲范围适配 mrna-lnp 制剂所需的中性微环境；在冷冻、冻融及冻干过程中，tris体系ph漂移幅度远小于磷酸盐缓冲液；tris可清除脂质氧化产生的醛类及羟基自由基，保护mrna完整性。

14、本发明中，所述制剂可以为疫苗，也可以为其它，本发明对此不做限定。所述制剂的具体剂型和使用形式可根据实际防治需求、给药途径以及目标人群等因素进行合理选择。在本发明的具体实施例中，所述制剂以疫苗的形式使用，用于hsv-2的防治。以疫苗形式使用时，所述制剂可通过诱导机体产生针对hsv-2的特异性免疫应答，从而实现对hsv-2感染的有效预防和控制。

15、本发明提供了如下a）~c）所示中的至少一种在制备防治hsv-2的药物和/或药物组合中的应用：

16、a）、本发明所述的hsv-2 糖蛋白b变体；

17、b）、本发明所述的核酸；

18、c）、本发明所述的制剂。

19、本发明提供了防治hsv-2的药物和/或药物组合，其原料包括如下a）~c）所述中的至少一种：

20、a）、本发明所述的hsv-2 糖蛋白b变体；

21、b）、本发明所述的核酸；

22、c）、本发明所述的制剂。

23、本发明通过将编码gb蛋白的原始mrna序列进行特定点突变及序列优化修饰，然后将其包裹于脂质纳米颗粒中，制备获得所述hsv-2 mrna疫苗。动物实验结果显示，本发明所述的疫苗与未修饰的原始gb mrna疫苗相比，本发明疫苗能够显著提升小鼠体内的中和抗体滴度，并在攻毒后为小鼠提供充分的保护，显著提升存活率，为hsv-2的预防提供了一种免疫原性更强、更安全有效的疫苗候选方案。