修饰核苷酸、基因芯片及其合成方法、系统与流程

本发明涉及基因芯片合成，尤其涉及一种修饰核苷酸、基因芯片及其合成方法、系统。

背景技术：

1、目前，核苷酸序列的化学合成主要采用亚磷酰胺化学合成法。该方法的基本原理是：在核苷酸分子的五碳糖5'位羟基上连接保护基，暂时封闭该位的反应活性，同时保留3'位的活性以便进行链延伸反应。通过去保护、连接的循环操作，按照设计序列逐步合成目标核酸链。

2、在上述合成方法中，根据去保护方式的不同，可分为电化学合成法和光化学合成法。电化学合成法采用酸敏感保护基，例如二甲氧基三苯甲基（dimethoxytrityl，简称dmt），通过电化学方式在局部产生酸性环境去除保护基。光化学合成法则采用光敏感保护基，例如thiophenyl-nppoc分子（thiophenyl-2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl，硫代苯基-2-(2-硝基苯基)丙氧羰基），通过紫外光照射去除保护基。光化学合成法结合光刻技术，可在芯片上定点并行合成大量不同序列的核酸探针，是实现高密度dna芯片生产的主要技术路线。

3、然而，无论是电化学合成还是光化学合成，在保护基的设计与应用中，现有技术普遍关注的是对核苷酸5'位的修饰与保护，而对核苷酸其他位点的功能性修饰则研究较少。需要注意的是，在核苷酸合成过程中，控制核苷酸何时参与反应的关键机制通常依赖于5'位保护基的去除。这意味着，一旦5'位保护基因环境因素发生非特异性去除，例如电化学合成中微量酸的存在或光化学合成中杂散光的照射，该核苷酸即获得反应活性，可能导致非预期的连接反应，从而引入序列误差。

4、因此，本领域亟需一种新型的修饰核苷酸，其反应活性能够被独立于现有保护机制的方式进行调控，从而在核酸合成过程中实现更精确的链延伸控制。

技术实现思路

1、本发明提供一种修饰核苷酸、基因芯片及其合成方法、系统，用以提供一种在五碳糖的3'位连接有非线性光敏保护基的修饰核苷酸，该修饰核苷酸基于非线性光敏保护基的阈值响应特性，将核苷酸的反应活性从现有技术中易受干扰的5'位单点控制，转变为由3'位主导的阈值控制，使得低剂量的环境杂散光等干扰无法触发保护基脱离，解决了现有技术中因环境干扰所导致的序列误差问题，提高了核酸合成的选择性与保真度。

2、本发明提供一种修饰核苷酸，所述修饰核苷酸的五碳糖的3'位连接有非线性光敏保护基，所述非线性光敏保护基在累积光通量小于预设光通量阈值时保持连接、在累积光通量大于或等于所述预设光通量阈值时脱离所述3'位。

3、根据本发明提供的一种修饰核苷酸，所述非线性光敏保护基为重氮萘醌类化合物。

4、根据本发明提供的一种修饰核苷酸，所述修饰核苷酸的五碳糖的5'位还连接有线性光敏保护基。

5、根据本发明提供的一种修饰核苷酸，所述线性光敏保护基为nppoc、menpoc、o-nboc或npeoc中的任一种。

6、本发明还提供一种基因芯片合成方法，包括：

7、提供基底，所述基底上固定有第一核苷酸；

8、向所述基底上输送第二核苷酸，所述第二核苷酸采用如上所述的修饰核苷酸；

9、通过掩模版对所述基底进行图案化曝光，使得所述基底上的第一区域接收到的累积光通量大于或等于预设光通量阈值、且所述基底上的第二区域接收到的累积光通量小于所述预设光通量阈值，以控制所述第二核苷酸与所述第一核苷酸之间的连接。

10、根据本发明提供的一种基因芯片合成方法，所述控制所述第二核苷酸与所述第一核苷酸之间的连接，包括：

11、在所述第一区域，所述第二核苷酸的所述非线性光敏保护基脱离，所述第二核苷酸通过3'位与所述第一核苷酸连接；

12、在所述第二区域，所述第二核苷酸的所述非线性光敏保护基保持连接，所述第二核苷酸不与所述第一核苷酸连接。

13、根据本发明提供的一种基因芯片合成方法，所述掩模版为可编程光刻掩模版，所述可编程光刻掩模版包括多个可独立控制透光状态的像素单元。

14、根据本发明提供的一种基因芯片合成方法，所述像素单元处于开态时的第一透光率为70%-80%，所述像素单元处于关态时的第二透光率为10%-30%。

15、根据本发明提供的一种基因芯片合成方法，所述图案化曝光满足如下条件：

16、i×toff×t

17、其中，i为所述可编程光刻掩模版上的入射光强，t为曝光时间，i0为所述预设光通量阈值，ton为所述第一透光率，toff为所述第二透光率。

18、根据本发明提供的一种基因芯片合成方法，所述通过掩模版对所述基底进行图案化曝光，使得所述基底上的第一区域接收到的累积光通量大于或等于所述预设光通量阈值、且所述基底上的第二区域接收到的累积光通量小于所述预设光通量阈值，以控制所述第二核苷酸与所述第一核苷酸之间的连接之后，还包括：

19、去除未连接的第二核苷酸；

20、向所述基底输送新的第二核苷酸，重复执行曝光照射和核苷酸连接，直至获得目标核酸序列。

21、本发明还提供一种基因芯片，采用如上任一项所述的基因芯片合成方法制备得到。

22、本发明还提供一种基因芯片合成系统，包括：

23、可编程光刻掩模版，用于产生图案化的光，所述可编程光刻掩模版包括多个可独立控制透光状态的像素单元；

24、光源，用于以预设光强照射所述可编程光刻掩模版；

25、芯片承载台，用于固定基底，所述基底上固定有第一核苷酸；

26、流体输送单元，用于向所述基底输送第二核苷酸，所述第二核苷酸采用如上所述的修饰核苷酸；

27、控制装置，用于控制所述可编程光刻掩模版的像素状态，使得所述图案化的光中，对应于目标连接位置的第一区域接收到的累积光通量大于或等于预设光通量，对应于非目标连接位置的第二区域接收到的累积光通量小于所述预设光通量阈值。

28、本发明提供的修饰核苷酸、基因芯片及其合成方法、系统，通过在五碳糖的3'位连接非线性光敏保护基，为核苷酸的反应活性增加了一个独立于5'位保护机制的全新调控位点。该非线性光敏保护基在累积光通量低于阈值时保持连接，使得低剂量环境干扰无法触发3'位去保护，从而消除了非特异性激活的风险；在累积光通量达到或超过阈值时才发生脱离，实现了反应活性的阈值控制。由此，在核酸合成过程中，即使5'位保护基因环境因素误脱除，只要3'位保护基未被去除，该核苷酸仍无法参与链延伸反应，从而实现了反应活性的冗余控制，解决了现有技术中因环境干扰所导致的序列误差问题，提高了核酸合成的选择性与保真度。

1.一种修饰核苷酸，其特征在于，所述修饰核苷酸的五碳糖的3'位连接有非线性光敏保护基，所述非线性光敏保护基在累积光通量小于预设光通量阈值时保持连接、在累积光通量大于或等于所述预设光通量阈值时脱离所述3'位。

2.根据权利要求1所述的修饰核苷酸，其特征在于，所述非线性光敏保护基为重氮萘醌类化合物。

3.根据权利要求1所述的修饰核苷酸，其特征在于，所述修饰核苷酸的五碳糖的5'位还连接有线性光敏保护基。

4.根据权利要求3所述的修饰核苷酸，其特征在于，所述线性光敏保护基为nppoc、menpoc、o-nboc或npeoc中的任一种。

5.一种基因芯片合成方法，其特征在于，包括：

6.根据权利要求5所述的基因芯片合成方法，其特征在于，所述控制所述第二核苷酸与所述第一核苷酸之间的连接，包括：

7.根据权利要求5所述的基因芯片合成方法，其特征在于，所述掩模版为可编程光刻掩模版，所述可编程光刻掩模版包括多个可独立控制透光状态的像素单元。

8.根据权利要求7所述的基因芯片合成方法，其特征在于，所述像素单元处于开态时的第一透光率为60%-80%，所述像素单元处于关态时的第二透光率为10%-30%。

9.根据权利要求8所述的基因芯片合成方法，其特征在于，所述图案化曝光满足如下条件：

10.根据权利要求5至9中任一项所述的基因芯片合成方法，其特征在于，所述通过掩模版对所述基底进行图案化曝光，使得所述基底上的第一区域接收到的累积光通量大于或等于所述预设光通量阈值、且所述基底上的第二区域接收到的累积光通量小于所述预设光通量阈值，以控制所述第二核苷酸与所述第一核苷酸之间的连接之后，还包括：

11.一种基因芯片，其特征在于，采用权利要求5至10中任一项所述的基因芯片合成方法制备得到。

12.一种基因芯片合成系统，其特征在于，包括：