一种多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体及其制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种酶活提高的多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、丝氨酸棕榈酰转移酶（serine palmitoyltransferase，spt，ec 2.3.1.50）是鞘脂从头合成途径的起始酶和关键限速酶，催化l-丝氨酸与棕榈酰辅酶a缩合形成3-酮二氢鞘氨醇（3-ketodihydrosphingosine，3-kds或3-ks）。鞘脂是真核细胞质膜的重要组成成分，参与胚胎发育、内环境稳态调节、细胞凋亡和机体免疫等多种关键生物学过程。spt的酶活水平直接决定鞘脂的合成通量，因此对该酶的调控具有重要的基础研究价值和潜在应用前景。

2、目前对spt的研究主要集中于真核生物来源的膜结合型异源二聚体酶，该类酶结构复杂、难以体外大量制备且不易进行高分辨率结构解析。相比之下，革兰氏阴性菌多食鞘氨醇杆菌（sphingobacterium multivorum）来源的spt为水溶性同源二聚体，可在大肠杆菌中高效过表达并纯化，且与真核spt具有约30%的序列同源性及保守的催化残基，被认为是研究spt催化机制和底物识别的理想原核模型。然而，天然smspt的催化活性有限，难以满足鞘脂及其衍生物生物合成等应用场景对高效酶催化剂的需求。因此，通过蛋白质工程手段对smspt进行分子改造、提升其酶活，对于深入理解spt的催化机制及推动鞘脂类化合物的绿色生物制造具有重要意义。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种酶活提高的多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体及其制备方法和应用。其中，突变体y27h、n52y、f338a、y27h/n52y、y27h/f338a、n52y/f338a、y27h/n52y/f338a、v355l、s356r的酶活力均有所提高，分别提升了18.4%、86.0%、159.6%、98.5%、169.8%、248.4%、267.2%、43.1%、85.9%，本发明获得的丝氨酸棕榈酰转移酶突变体酶活力得到显著提高，具有较大的工业应用潜力和经济价值。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、一种多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体，其氨基酸序列为seq id no：1经如下任意一种突变而得：

4、y27h、n52y、f338a、v355l、s356r中的至少一个；其中，y27h即第27位氨基酸由y突变为h，其他同理。

5、进一步的，多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体，其氨基酸序列为seq idno：1经如下任意一种突变而得：

6、y27h、n52y、f338a、y27h/n52y、y27h/f338a、n52y/f338a、y27h/n52y/f338a、v355l或s356r。

7、编码seq id no：1所示氨基酸序列的基因序列如seq id no：2所示。

8、一种所述多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体的编码基因。

9、优选的，多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体y27h/n52y/f338a，其氨基酸序列如seq id no：3所示。所述突变体的第27位，52位氨基酸和第338位氨基酸分别由酪氨酸y、天冬酰胺n和苯丙氨酸f突变为组氨酸h、酪氨酸y和丙氨酸a。

10、多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体y27h/n52y/f338a的编码基因，其核苷酸序列如seq id no：4所示。

11、上述突变体相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

12、（a）含有上述编码基因的表达盒；

13、（b）含有上述编码基因的重组表达载体；

14、（c）含有（a）中所述表达盒的重组表达载体；

15、（d）含有上述编码基因的重组菌；

16、（e）含有（a）中所述表达盒的重组菌；

17、（f）含有（b）或（c）中所述重组表达载体的重组菌。

18、进一步的，（a）中所述表达盒使用的表达元件是：t7启动子，6*his亲和标签和t7终止子。

19、所述的6*his亲和标签位于丝氨酸棕榈酰转移酶及其突变体的c端。

20、进一步的，（b）、（c）中所述重组表达载体的出发载体为pet系列的载体等；优选为pet-28a(+)载体。

21、进一步的，（d）、（e）、（f）中所述重组菌对应的宿主菌选自原核生物或酵母等；所述原核生物包括大肠杆菌属等细菌；所述酵母包括解脂耶氏酵母等酵母。更具体而言，所述原核生物是大肠杆菌bl21(de3)；所述酵母是解脂耶氏酵母po1f。

22、上述突变体、编码基因或突变体相关的生物材料在制备酶活提高的多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体中的应用。

23、上述突变体、编码基因或突变体相关的生物材料在生产鞘脂类化合物中的应用。

24、进一步的，所述鞘脂类化合物包括二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇和神经酰胺等中的至少一种。

25、一种获得上述突变体的方法，包括如下步骤：通过设计含有突变位点的引物对编码氨基酸序列如seq id no：1所示的多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶的基因进行定点突变后表达，得到多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体。

26、进一步的，设计含有突变位点的引物向编码氨基酸序列如seq id no：1所示的多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶的基因中引入突变，经测序正确后转化至大肠杆菌bl21(de3)中进行表达，得到多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶突变体。

27、本发明具体实施步骤如下：

28、1. 构建丝氨酸棕榈酰转移酶突变体重组表达载体：1）将经密码子优化后合成的丝氨酸棕榈酰转移酶野生型基因连接至含有t7启动子，6*his亲和标签和t7终止子的pet-28a(+)载体上，构建表达质粒pet28a-smspt；2）通过重叠pcr扩增定点突变野生丝氨酸棕榈酰转移酶，获得相应的丝氨酸棕榈酰转移酶突变体表达质粒。

29、2. 丝氨酸棕榈酰转移酶突变体重组工程菌及以此制备酶活提高的丝氨酸棕榈酰转移酶：将丝氨酸棕榈酰转移酶突变体表达质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)中，得到重组工程菌；之后经发酵得到丝氨酸棕榈酰转移酶突变体。

30、3. 丝氨酸棕榈酰转移酶突变体酶学性质的表征：以丝氨酸和棕榈酰辅酶a为底物，基于使用微孔比色法测定突变体的酶学性质。

31、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

32、本发明通过对多食鞘氨醇杆菌丝氨酸棕榈酰转移酶的特定位点进行定点突变改造，共获得了9个酶活力提高的突变体，包括5个单位点突变的突变体及4个组合突变体；相较于野生型，突变体y27h、n52y、f338a、y27h/n52y、y27h/f338a、n52y/f338a、y27h/n52y/f338a、v355l、s356r的酶活力均有所提高，分别提升了18.4%、86.0%、159.6%、98.5%、169.8%、248.4%、267.2%、43.1%、85.9%，本发明获得的丝氨酸棕榈酰转移酶突变体酶活力得到显著提高，具有较大的工业应用潜力和经济价值。