一种氨基甲酸酯水解酶突变体及其应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种氨基甲酸酯水解酶突变体及其应用。

背景技术：

1、塑料制品是一种高分子聚合物，在现代生活中是必不可少的，并与人类的活动密切相关。由于塑料的广泛应用和低成本的生产，塑料的使用在近几十年来急剧增加。但高分子塑料制品在自然条件下难以降解，长期存在于自然环境中，对生态系统构成严重威胁，影响生物多样性。塑料主要来自于不可再生的化石燃料资源，只有一小部分废塑料被可持续地处理(例如，通过回收)，而剩余的大量废塑料要么被填埋，要么被释放到环境中。这些合成聚合物在自然界中的无害分解面临诸多挑战，其不断积累对人类健康和整个生态系统构成了重大威胁。

2、填埋与焚烧是当前处理塑料废弃物的主要方式。然而填埋法，将造成土地资源的极大浪费。焚烧会产生有害气体，对空气质量造成影响，并可能对人类健康构成威胁。因此，寻找更环保的塑料处理方法变得尤为重要。

3、相较于传统的废弃物处理方法，回收是一种对高分子塑料生命周期末端处理更为理想的途径。目前，机械回收是主要的回收方法，但其缺点是产生价值较低的“降级”产品。化学回收可将高分子材料分解为基本的烃类单体，这些单体可作为化学工业的合成原料，实现材料的“升级”使用。然而，这些方法普遍存在能耗高的问题，难以满足可持续发展的要求。

4、相比之下，生物法利用自然界中的微生物或酶将高分子塑料分解为小分子单体。与物理和化学方法相比，生物降解法更为环保。采用酶法对高分子塑料进行生物降解是一种高效、温和且环保的解决方案。作为一种具有潜力的可持续方案，生物法降解塑料能够更有效地分解废弃塑料，从而减少对生态环境的不利影响。

5、smah在降解双(4-羟基丁基)(4-甲基-1,3-苯基)二氨基甲酸酯((4-hydroxybutyl)(4-methyl-1,3-phenyl)dicarbamate,btc)方面展现出一定的潜力，但是其对btc的降解活性较低。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是如何提高氨基甲酸酯或其聚合物的降解效率。

2、为了解决上述技术方案，本发明第一方面提供了smah的突变体蛋白，为如下任一种：

3、a1)所示的突变体蛋白包括将seq id no:2所示的氨基酸序列上第367位和第381位氨基酸残基突变，其他位置的氨基酸残基不变，得到具有氨基甲酸酯水解酶活性的蛋白；该蛋白命名为p367a/l381a。

4、a2)所示的突变体蛋白包括将seq id no:2所示的氨基酸序列上第381位氨基酸残基突变，其他位置的氨基酸残基不变，得到具有氨基甲酸酯水解酶活性的蛋白；该蛋白命名为l381a。

5、a3)所示的突变体蛋白包括将seq id no:2所示的氨基酸序列上第367位氨基酸残基突变，其他位置的氨基酸残基不变，得到具有氨基甲酸酯水解酶活性的蛋白；该蛋白命名为p367a。

6、a4)在a1)-a3)任一所示突变体蛋白中除了所述突变氨基酸残基外，其他氨基酸残基同源性大于99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有相同功能的蛋白；

7、a5)所示的突变体蛋白包括在a1)-a4)任一所示蛋白的n端或/和c端连接标签得到序列所示的蛋白。

8、上文所述变体蛋白中，所述突变为如下：

9、所述第367位氨基酸残基突变为脯氨酸突变为丙氨酸；

10、所述第381位氨基酸残基突变为亮氨酸突变为丙氨酸。

11、上文所述变体蛋白中，所述smah的突变体蛋白的活性高于seq id no：2所示氨基甲酸酯水解酶smah。所述野生型smah来自sphingomonas melonis。

12、上文所述变体蛋白中，所述a1)所示的突变体蛋白的氨基酸序列包括seq id no:10第24-461位；

13、所述a2)所示的突变体蛋白的氨基酸序列包括seq id no:8第24-461位；

14、所述a3)所示的突变体蛋白的氨基酸序列包括seq id no:6第24-461位。

15、上文所述变体蛋白中，所述a1)所示的蛋白质的氨基酸序列可以为seq id no:10第24-461位或seq id no:10；

16、所述a2)所示的突变体蛋白的氨基酸序列可以为seq id no:8第24-461位或seqid no:8；

17、所述a3)所示的突变体蛋白的氨基酸序列可以为seq id no:6第24-461位或seqid no:6。

18、第二方面，本发明提供了与第一方面所述突变体蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b4)中的任一种：

19、b1)编码第一方面所述突变体蛋白的核酸分子；

20、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

21、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

22、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。

23、上文所述生物材料中，

24、b1)所述核酸分子为如下任一种：

25、b1)所示核酸分子的核苷酸序列包括seq id no:9第70-1383位；

26、b2)所示核酸分子的核苷酸序列包括seq id no:7第70-1383位；

27、b3)所示核酸分子的核苷酸序列包括seq id no:5第70-1383位；

28、b4)与b1)-b3)中任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码第一方面中任一所述突变体蛋白的cdna分子或dna分子；

29、b5)在严格条件下与b1)-b3)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码第一方面中任一所述突变体蛋白的cdna分子或dna分子。

30、上文所述b1)所述核酸分子中，

31、b1)所示核酸分子的核苷酸序列可以为seq id no:9第70-1383位或seq id no:9；

32、b2)所示核酸分子的核苷酸序列可以为seq id no:7第70-1383位或seq id no:7；

33、b3)所示核酸分子的核苷酸序列可以为seq id no:5第70-1383位或seq id no:5；

34、上文所述生物材料中，所述重组载体的载体骨架来源于pet-32a(+)；

35、上文所述生物材料中，所述重组微生物为大肠杆菌。

36、第三方面，本发明提供了第一方面所述突变体蛋白在如下任一应用：

37、c1)作为氨基甲酸酯或其聚合物的水解酶；

38、c2)催化氨基甲酸酯或其聚合物水解；

39、c3)降解氨基甲酸酯或其聚合物；

40、c4)催化btc水解为2,6-二氨基甲苯；

41、c5)制备氨基甲酸酯或其聚合物降解剂；

42、c6)制备催化氨基甲酸酯或其聚合物水解产品；

43、c7)制备降解氨基甲酸酯或其聚合物产品；

44、c8)制备催化btc水解为2,6-二氨基甲苯产品。

45、上文所述应用中，所述氨基甲酸酯聚合物可以为氨基甲酸酯高聚物或氨基甲酸酯低聚物；进一步地，所述氨基甲酸酯低聚物可以为btc。

46、第四方面，本发明提供了第二方面所述的生物材料在如下任一应用：

47、c2)催化氨基甲酸酯或其聚合物水解；

48、c3)降解氨基甲酸酯或其聚合物；

49、c4)催化btc水解为2,6-二氨基甲苯；

50、c5)制备氨基甲酸酯或其聚合物降解剂；

51、c6)制备催化氨基甲酸酯或其聚合物水解产品；

52、c7)制备降解氨基甲酸酯或其聚合物产品；

53、c8)制备催化btc水解为2,6-二氨基甲苯产品；

54、c9)制备氨基甲酸酯或其聚合物水解酶。

55、上文所述应用中，所述氨基甲酸酯聚合物可以为氨基甲酸酯高聚物或氨基甲酸酯低聚物；进一步地，所述氨基甲酸酯低聚物可以为btc。

56、第五方面，本发明提供了一种水解氨基甲酸酯或其聚合物的方法，包括如下步骤：用第一方面中所述突变体蛋白或第二方面所述的生物材料处理具有氨基甲酸酯键的高分子材料，实现氨基甲酸酯或其聚合物的水解。

57、上文所述方法中，所述具有氨基甲酸酯键的高分子材料可以为氨基甲酸酯低聚物，进一步地，具体可以为btc。

58、第六方面，本发明提供了一种制备2,6-二氨基甲苯的方法，包括如下步骤：用第一方面任一所述突变体蛋白或第二方面所述的生物材料处理btc，得到2,6-二氨基甲苯。

59、上文所述处理为将btc或具有氨基甲酸酯键的高分子材料与第一方面任一所述突变体蛋白在100mm甘氨酸-naoh缓冲液(ph10.0)中反应。

60、上述反应的温度可以为45℃，反应的时间可以为30min。

61、本发明的实验证明，利用结构分析及定点突变技术将野生型smah进行突变，得到了smah突变体p367a、l381a、双突变p367a/l381a，改变野生型smah酶活性低的问题，有效提高smah降解btc的活性，提升smah催化效率。这一发现为高分子塑料的生物降解研究提供了更为坚实的理论基础和实验依据，对维护绿色生态环境具有重要且积极的意义。本发明smah突变体提高了对氨基甲酸酯高聚物或低聚物的降解效率，工业化应用前景良好。