CRISPR-Cas9自噬相关基因文库筛选卵巢癌铂耐药逆转靶点及应用的制作方法

本发明涉及肿瘤药理学、分子生物学、基因功能筛选及肿瘤耐药治疗领域，具体涉及crispr-cas9自噬相关基因文库序列及基于crispr-cas9自噬相关基因文库筛选卵巢癌铂耐药逆转靶点的方法，以及phb2和sec24c作为逆转卵巢癌铂耐药分子靶点的应用。

背景技术：

1、卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，具有早期症状隐匿、复发率高和死亡率高等特点。目前，卵巢癌的主要治疗方式仍以肿瘤细胞减灭术联合铂类药物化疗为主。多数患者在初始治疗阶段对铂类药物具有一定敏感性，但随着治疗周期增加，部分患者会出现复发并逐渐形成获得性铂耐药。铂耐药的发生显著降低了化疗疗效，是导致卵巢癌治疗失败和患者预后不良的重要原因。因此，寻找能够逆转卵巢癌铂耐药的新型分子靶点具有重要意义。

2、自噬是一种依赖溶酶体的细胞内降解和物质循环过程，能够降解受损细胞器、异常蛋白及其他细胞内容物，从而维持细胞稳态。在肿瘤细胞中，自噬既可参与细胞稳态维持，也可在化疗、缺氧、营养缺乏及氧化应激等压力条件下发挥保护性作用。当肿瘤细胞受到铂类药物刺激时，自噬活性可能升高，以帮助细胞清除受损组分、缓解代谢压力并降低药物诱导的细胞死亡，从而促进耐药细胞存活。

3、目前，针对自噬相关耐药的干预多采用氯喹、羟氯喹等广谱自噬抑制剂。这类药物主要通过影响溶酶体功能阻断自噬流后期过程，但其作用机制较为宽泛，除影响自噬外，还可能干扰溶酶体相关的其他细胞过程，存在选择性不足和潜在脱靶效应等问题。因此，仅依赖广谱自噬抑制剂难以实现对卵巢癌铂耐药的精准干预，仍需寻找更加明确、特异的自噬相关耐药靶点。

4、crispr-cas9文库筛选技术能够在基因功能层面系统性识别肿瘤细胞在药物压力下的关键依赖基因，为发现耐药相关靶点提供了有效工具。与传统候选基因验证相比，基于特定功能基因集的crispr筛选能够直接从细胞凋亡表型出发，筛选真正参与药物耐受维持的关键分子。对于卵巢癌铂耐药而言，利用自噬相关基因文库进行功能筛选，有助于发现与铂类药物耐受密切相关的自噬或膜转运相关基因。

5、然而，现有技术中关于卵巢癌铂耐药的研究多集中于已知耐药通路或广谱自噬抑制策略，对于卵巢癌铂耐药细胞在自噬相关基因层面的生存依赖性仍缺乏明确认识。尤其是phb2和sec24c等基因在卵巢癌铂耐药维持中的作用尚未被充分揭示，也尚未见其作为逆转卵巢癌铂耐药靶点的应用。因此，开发以phb2和sec24c为靶点的铂耐药逆转策略，有望为提高卵巢癌铂类药物治疗效果提供新的技术方案。

技术实现思路

1、针对现有技术中卵巢癌铂耐药治疗效果有限、广谱自噬抑制剂选择性不足，以及缺乏明确可用于逆转卵巢癌铂耐药的自噬相关靶点等问题，本发明提供crispr-cas9自噬相关基因文库序列以及一种基于crispr-cas9自噬相关基因文库筛选卵巢癌铂耐药逆转靶点的方法，并提供phb2（抑制素2）和sec24c（sec24同源物c）作为逆转卵巢癌铂耐药靶点的应用。

2、第一方面，本发明提供crispr-cas9自噬相关基因文库序列，包括碱基序列seq idno:1～1718。具体序列如下：

3、第二方面，本发明提供一种筛选卵巢癌铂耐药逆转靶点的方法，包括：将crispr-cas9自噬相关基因文库导入卵巢癌铂耐药细胞；经顺铂处理后，根据细胞死亡或存活状态分选细胞；提取基因组dna并进行sgrna高通量测序；通过分析sgrna丰度变化筛选与卵巢癌铂耐药相关的候选基因。进一步地，所述细胞死亡或存活状态通过annexin v染色结合流式细胞术进行区分。进一步地，所述候选基因包括phb2和/或sec24c。

4、第三方面，本发明提供phb2和/或sec24c作为筛选逆转卵巢癌铂耐药药物的分子靶点的应用。降低phb2或sec24c表达、或抑制phb2或sec24c功能的候选药物，可作为逆转卵巢癌铂耐药的候选药物。

5、第四方面，本发明提供phb2和/或sec24c作为自噬相关基因参与卵巢癌铂耐药的应用。

6、第五方面，第五方面，本发明提供phb2抑制剂和/或者sec24c抑制剂在制备逆转卵巢癌铂耐药的药物中的应用。进一步地，所述phb2抑制剂为降低phb2表达水平的核酸干预试剂。优选为靶向phb2的sirna，其序列为：

7、 si-phb2#1：5’-gctacatcaaacttcgcaa-3’；

8、si-phb2#2：5’-cagaatcgtatctatctca-3’；

9、si-phb2#3：5’-ctacagatggtgaatatct-3’。

10、进一步地，所述sec24c抑制剂为降低sec24c表达水平的核酸干预试剂，优选为靶向sec24c的sirna，其序列为：si-sec24c：5’-gtagattactgcaagaaca-3’。所述药物用于提高卵巢癌铂耐药细胞对顺铂的敏感性，或用于增强顺铂诱导的卵巢癌铂耐药细胞死亡或凋亡。

11、有益效果

12、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

13、本发明基于crispr-cas9自噬相关基因文库筛选，发现phb2和sec24c与卵巢癌铂耐药细胞在药物压力下的存活维持相关，为卵巢癌铂耐药提供了新的自噬相关候选靶点。

14、本发明证实，抑制phb2能够逆转卵巢癌铂耐药细胞对铂类药物的耐药性，并增强铂类药物诱导的细胞死亡或凋亡；sec24c也可作为逆转卵巢癌铂耐药的潜在候选靶点，为耐药细胞背景特异性的治疗策略提供依据。

15、本发明提供的phb2抑制剂或sec24c抑制剂分别与顺铂联合应用策略，相较于传统广谱自噬抑制剂具有更明确的分子靶向性，可为提高卵巢癌铂类药物治疗效果、克服铂耐药提供新的技术方案。

1.crispr-cas9自噬相关基因文库序列，包括碱基序列seq id no:1～1718。

2.一种筛选卵巢癌铂耐药逆转靶点的方法，其特征在于，包括：将权利要求1中的crispr-cas9自噬相关基因文库导入卵巢癌铂耐药细胞，经顺铂处理后，根据细胞死亡或存活状态分选细胞，提取基因组dna并进行sgrna高通量测序，通过分析sgrna丰度变化筛选与卵巢癌铂耐药相关的候选基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞死亡或存活状态通过annexin v染色结合流式细胞术进行区分。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述筛选出的候选基因包括phb2和sec24c。

5.phb2和/或sec24c作为筛选逆转卵巢癌铂耐药药物的分子靶点的应用。

6.phb2和/或sec24c作为自噬相关基因参与卵巢癌铂耐药的应用。

7.phb2抑制剂和/或者sec24c抑制剂在制备逆转卵巢癌铂耐药的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述phb2抑制剂为降低phb2表达水平的核酸干预试剂；所述sec24c抑制剂为降低sec24c表达水平的核酸干预试剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述phb2抑制剂为靶向phb2的sirna，其序列为：