一种增强型抗实体瘤的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞及其构建方法和应用

本发明涉及生物医药，特别是涉及一种增强型抗实体瘤的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞及其构建方法和应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体（car）技术通过人工改造免疫细胞，使其能够特异性识别肿瘤相关抗原并发挥抗肿瘤作用，已成为继免疫检查点抑制剂之后的重要肿瘤免疫治疗策略。目前，以t细胞为基础的car-t治疗在血液系统恶性肿瘤中取得了显著疗效，但由于实体瘤具有复杂的肿瘤微环境、免疫抑制状态、抗原异质性以及细胞治疗产品难以有效浸润肿瘤组织等限制因素，car-t治疗在实体瘤中的应用仍面临较大挑战。

2、近年来，巨噬细胞因其天然具有肿瘤浸润能力、吞噬能力、抗原呈递功能以及调节肿瘤免疫微环境的能力，嵌合抗原受体巨噬细胞（car-m）被认为是实体瘤免疫治疗的重要候选方案。然而，传统car-m仍存在实体瘤浸润不足、持续杀伤能力有限以及难以有效控制肿瘤转移等问题。

3、已有研究尝试通过基因工程方式向car-m中过表达趋化相关分子，但该策略仅改善细胞迁移能力，无法同时赋予car-m更强的肿瘤杀功效。因此，如何构建具有多重抗肿瘤功能的新型、治疗产品，是目前实体瘤免疫治疗领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种增强型抗实体瘤的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞能够有效识别、杀伤及清除肿瘤细胞。

2、中性粒细胞作为人体内数量最丰富的先天免疫细胞之一，具有天然趋向炎症和肿瘤区域迁移的能力。肿瘤组织产生的cxcl家族趋化因子能够通过作用于中性粒细胞表面的cxcr2受体，促进中性粒细胞向肿瘤部位募集。此外，中性粒细胞还能够通过活性氧（ros）生成、中性粒细胞胞外诱捕网（nets）释放等方式发挥抗肿瘤作用。本发明通过诱导表达嵌合抗原受体的巨噬细胞与中性粒细胞发生细胞融合，使所得s-car-m同时保留car-m来源的抗原特异性识别、吞噬及免疫调节功能，并获得中性粒细胞来源的肿瘤趋化、活性氧生成以及中性粒细胞胞外诱捕网释放等功能特征。该融合策略能够在单一细胞体系内整合两类免疫细胞的优势功能，增强细胞向实体瘤区域迁移和富集的能力，并提高对肿瘤细胞的识别、杀伤及清除能力。

3、基于此，本发明提供了如下方案：

4、本发明提供一种增强型抗实体瘤的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞的制备方法，包括将嵌合抗原受体巨噬细胞和中性粒细胞进行细胞融合，得到所述增强型抗实体瘤的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞的步骤。

5、进一步地，所述嵌合抗原受体巨噬细胞是将嵌合抗原受体的编码基因导入巨噬细胞得到。

6、进一步地，采用慢病毒转染方式将所述嵌合抗原受体的编码基因导入所述巨噬细胞。

7、进一步地，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域以及胞内信号结构域。

8、进一步地，所述抗原结合结构域针对的肿瘤相关抗原为her2、egfr、epcam或cd19。

9、进一步地，所述细胞融合采用的诱导方法为聚乙二醇介导融合法、电融合法、膜融合诱导剂介导融合法、病毒介导融合法或受体-配体介导的细胞融合法。

10、本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞。

11、本发明还提供上述的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞在制备用于治疗实体瘤的药物中的应用。

12、进一步地，所述实体瘤为结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤或转移性肿瘤。

13、本发明还提一种用于治疗实体瘤的药物，活性成分包括上述的合胞嵌合抗原受体巨噬细胞。

14、本发明公开了以下技术效果：

15、（1）赋予car-m增强的肿瘤趋化和实体瘤浸润能力

16、传统car-m主要依赖局部输注后的随机迁移或肿瘤微环境中的有限募集作用，在实体瘤组织中的有效浸润能力受到限制。本发明通过将car-m与中性粒细胞融合，使所得s-car-m获得中性粒细胞来源的天然炎症趋化特征，能够响应肿瘤微环境中的趋化信号，提高向肿瘤组织迁移和富集的能力。因此，s-car-m能够更加有效地进入实体瘤区域，并提高后续抗肿瘤效应的发挥效率。

17、（2）实现多机制协同的抗肿瘤作用

18、本发明获得的s-car-m同时保留car-m来源的人工抗原识别功能以及中性粒细胞来源的天然免疫效应功能。其中，car结构赋予s-car-m针对目标肿瘤抗原的特异性识别能力，使其能够精准定位并攻击表达相应抗原的肿瘤细胞；巨噬细胞来源的吞噬功能能够促进肿瘤细胞清除，并参与抗原处理和免疫调节；中性粒细胞来源的功能特征能够进一步增强活性氧生成、胞外诱捕结构形成以及炎症免疫反应。通过上述多功能整合，s-car-m依赖活性氧生成、胞外诱捕网释放促进肿瘤细胞“胞葬识别”信号——磷脂酰丝氨酸的外翻，从而提高对肿瘤细胞的吞噬能力，并增强后续的抗原处理与提呈过程，发挥更强的体内免疫激活作用。

19、（3）通过表位扩散增强广谱抗肿瘤免疫，降低抗原逃逸

20、实体瘤通常具有显著的抗原异质性，部分肿瘤细胞可通过降低或丢失car靶向抗原表达逃避免疫识别，从而限制传统car细胞治疗效果。本发明中的s-car-m在靶向杀伤抗原阳性肿瘤细胞的同时，能够促进肿瘤细胞死亡、肿瘤抗原释放以及抗原呈递过程，进一步激活宿主免疫系统针对其他肿瘤相关抗原产生免疫应答。该过程可诱导抗肿瘤免疫表位扩散，扩大免疫识别范围，使机体能够识别并攻击car靶抗原低表达或缺失的肿瘤细胞。因此，本发明能够有效降低由于肿瘤抗原异质性导致的免疫逃逸，提高治疗持续性和抗肿瘤广谱性。

21、（4）促进内源性免疫激活，形成持续抗肿瘤免疫反应

22、相比单纯依赖外源输入工程化细胞发挥作用的传统细胞治疗策略，本发明中的s-car-m能够通过巨噬细胞来源的抗原处理和免疫调节功能，促进肿瘤抗原暴露及呈递，并进一步激活宿主t细胞等内源性免疫细胞。因此，s-car-m不仅能够直接发挥抗肿瘤作用，还能够促进机体形成更广泛和持续的抗肿瘤免疫状态。

23、（5）可与现有肿瘤治疗方法联合应用，提高综合治疗效果

24、本发明所构建的s-car-m具有较好的肿瘤微环境适应能力和免疫激活能力，可与现有临床治疗方式联合使用，以进一步增强抗肿瘤效果。所述联合治疗方式包括但不限于：化学治疗、放射治疗、肿瘤手术切除或局部消融治疗、免疫检查点抑制治疗，包括pd-1/pd-l1、ctla-4等阻断策略、其他能够诱导肿瘤免疫原性死亡或增强抗肿瘤免疫反应的治疗方法。由于上述治疗方式能够促进肿瘤抗原释放、增强炎症信号或改善免疫微环境，而s-car-m能够进一步放大上述免疫效应，因此二者具有潜在协同作用。

25、（6）具有平台化开发潜力和广泛应用价值

26、本发明提出的细胞融合策略不依赖于特定car结构或单一肿瘤抗原，可根据不同肿瘤类型选择相应car-m体系，并进一步与中性粒细胞融合构建对应的s-car-m产品。因此，该技术能够拓展应用于多种实体瘤治疗，包括原发性实体瘤、转移性实体瘤以及治疗后复发性肿瘤，为新型细胞免疫治疗产品开发提供通用技术平台。