一种用于治疗牙周炎的多肽及其制备方法和应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种用于治疗牙周炎的多肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、牙周炎是一种常见的口腔慢性炎症性疾病，主要由局部因素（如菌斑和微生物）引起的牙周支持组织（包括牙龈、牙周膜、牙槽骨等）的退行性病变。牙周炎最主要的结果是导致牙龈和牙槽骨逐渐退缩，最终造成牙齿松动、脱落，是我国成年人牙齿缺失的主要原因之一。

2、牙周炎的传统治疗方法通常包括机械清创（如洗牙和根面平整）以及使用抗生素控制感染。然而，这些治疗方法存在诸多局限性：机械清创无法完全消除病原菌；长期使用抗生素可能导致细菌耐药性的产生；更为重要的是，现有治疗方法缺乏恢复受损牙周组织的再生能力。

3、近年来，随着对牙周炎发病机制研究的深入，发现铁死亡（ferroptosis）在牙周炎的病理进程中发挥重要作用。铁死亡是一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡方式。在牙周炎病变过程中，牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis）脂多糖（lps）可诱导巨噬细胞发生铁死亡，进而加剧局部炎症反应和组织损伤。动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，drp1）与酰基辅酶a合成酶长链家族成员4（acyl-coasynthetase long chain family member 4，acsl4）的相互作用是调控铁死亡的关键分子事件之一。因此，阻断drp1与acsl4的蛋白-蛋白相互作用，抑制巨噬细胞铁死亡，成为治疗牙周炎的潜在策略。

4、文献《curcumin attenuates periodontal injury via inhibitingferroptosis of ligature-induced periodontitis in mice》公开了姜黄素通过抑制铁死亡减轻结扎诱导的小鼠牙周炎损伤，证实铁死亡参与牙周炎的病理进程，且姜黄素能够显著下调acsl4和tfr1的表达、上调gpx4和slc7a11的表达，从而抑制铁死亡。该文献还公开了使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1能够减轻牙周炎小鼠的牙槽骨吸收和炎症反应，提示抑制铁死亡是治疗牙周炎的有效策略。

5、文献《ferroptosis: a promising therapeutic target for periodontitis》，公开了牙周炎微环境中铁死亡的分子机制，包括牙龈卟啉单胞菌lps通过tlr4/nf-κb通路下调slc7a11、丁酸积累上调ncoa4、促炎细胞因子通过stat3通路上调acsl4等三条促铁死亡通路协同作用，导致牙周细胞对铁死亡的易感性增加。该文献还系统总结了现有铁死亡抑制剂（如ferrostatin-1、去铁胺）、天然化合物（如白藜芦醇、姜黄素）及基因调控策略在牙周炎治疗中的应用现状，指出这些干预手段存在体内稳定性差、靶向性不足、生物利用度低等局限性。

6、因此，目前亟需开发一种能够特异性靶向阻断drp1与acsl4的蛋白-蛋白相互作用、同时具备良好细胞穿透能力和体内稳定性、并经过系统化学修饰优化的新型治疗性多肽，从上游机制抑制巨噬细胞铁死亡，从而有效治疗牙周炎。

技术实现思路

1、本发明的第一个方面提供了一种用于治疗牙周炎的多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述多肽的n端经乙酰化修饰，c端经酰胺化修饰。

2、seq id no.1：qkrltllaqq。

3、具体地，所述多肽的c端连接有细胞穿膜肽。

4、进一步具体地，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、seq id no.2：ygrkkrrqrrr。

6、可选地，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.3所示。

7、seq id no.3：ac-qkrltllaqq-ygrkkrrqrrr-nh2。

8、本发明的第二个方面提供了上述多肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

9、s1、树脂溶涨，称取rink amide am树脂，将树脂放入反应管中，加dcm；

10、s2、接氨基酸，通过沙芯抽滤掉溶剂，依次加入fmoc-l-arg(pbf)-oh氨基酸、diea、dmf溶解，振荡，用dmf和dcm交替清洗6遍；

11、s3、脱保护，加15ml 20%哌啶dmf溶液，静置，去掉再加15ml 20%哌啶dmf溶液，静置；

12、s4、检测，抽掉哌啶溶液，取树脂，用乙醇洗，依次加入茚三酮、kcn、苯酚溶液，105℃－110℃加热；

13、s5、洗涤，依次用dmf溶液、甲醇溶液和dmf溶液洗涤两次；

14、s6、缩合，保护氨基酸fmoc-l-arg(pbf)-oh、hbtu，均用dmf溶解，加入反应管，立刻加入dic反应；

15、s7、洗，依次用dmf洗涤一次，甲醇洗涤两次，dmf洗涤两次；

16、s8、重复步骤s2-s6的操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸，直至合成到n端最后一个氨基酸再进行s9；

17、s9、最后一个氨基酸脱完保护后洗，依次用dmf洗涤两次，甲醇洗涤两次。

18、s10、ac乙酰化封端，在nmm 、 dmf条件下加入ac2o，反应。

19、s11、从树脂上切割多肽，加入切割液切割120min；

20、s12、吹干洗涤，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干，得到粗品肽；

21、s13、纯化多肽，粗品肽通过反相hplc进行纯化，冻干后得到纯品肽。

22、具体地，s11中，所述切割液中，按质量比包括tfa 90-95%、水2-3%、苯酚 2-3%和tis 2-3%。

23、本发明的第三方面提供了上述多肽在制备治疗牙周炎的药物中的应用。

24、具体地，所述牙周炎为由牙龈卟啉单胞菌感染引起的牙周炎。

25、本发明的第四方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括上述多肽，以及药学上可接受的辅料。

26、具体地，所述药学上可接受的辅料包括但不限于：黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂或渗透压调节剂中的至少一种。

27、具体地，所述药物组合物的剂型包括但不限于：液体溶液、冻干粉、片剂、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、口腔分散片剂、舌下含片、植入剂、微针贴片、凝胶剂、乳膏或软膏中的至少一种。

28、具体地，所述药物组合物的给药方式包括但不限于口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。

29、本发明的第五方面提供了一种牙周炎的治疗方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上述多肽或药物组合物。

30、术语“受试者”包括可以引发免疫应答的活生物体（例如，哺乳动物）。受试者的实例包括人、灵长类动物、牛、马、山羊、绵羊、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪及其转基因物种。

31、术语“治疗(treat)”是指受试者的疾病、病症或不希望的病况的医学管理。治疗或预防益处包括改善的临床结果；减轻或缓解与疾病、病症或不希望的病况相关的症状；症状发生减少；改善的生活质量；更长的无疾病状态；减少疾病、病症或不希望的病况的程度；疾病状态的稳定；疾病进展的延迟；缓解；存活；延长的存活；或其任何组合。

32、术语“治疗有效量”是指药学上认为的有效给药剂量，即活性药物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的给药剂量可以有大范围的变化。

33、本文所用术语"adx1"，指adx1多肽（adx1 peptide），即本发明所述的经化学修饰的治疗性多肽，其氨基酸序列为ac-qkrltllaqq-ygrkkrrqrrr-nh2（seq id no.3），能够特异性阻断drp1与acsl4的蛋白-蛋白相互作用，抑制巨噬细胞铁死亡，可用于治疗牙周炎。

34、本文所用术语"acsl4"，指酰基辅酶a合成酶长链家族成员4（acyl-coasynthetase long chain family member 4），是铁死亡过程中催化花生四烯酸酯化的关键酶，与drp1的相互作用可调控脂质过氧化和铁死亡的发生。

35、本文所用术语"co-ip"，指免疫共沉淀（co-immunoprecipitation），是一种利用抗体特异性识别并结合目标蛋白，进而沉淀与该目标蛋白相互作用的蛋白质复合物，以验证蛋白质之间体内相互作用的实验技术。

36、本文所用术语"drp1"，指动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1），是一种介导线粒体分裂的gtpase蛋白，在铁死亡调控中发挥重要作用，可与acsl4形成蛋白-蛋白相互作用。

37、本文所用术语"micro-ct"，指微计算机断层扫描技术（micro computedtomography），是一种利用x射线对小型样本（如小鼠颌骨）进行高分辨率三维成像的技术，可用于评估牙槽骨吸收程度和骨参数分析。

38、本文所用术语"p.g.lps"，指牙龈卟啉单胞菌细胞壁内毒素（porphyromonasgingivalis lipopolysaccharides），是牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis）细胞壁外膜的主要成分，可诱导巨噬细胞炎症反应和铁死亡，是牙周炎的主要致病因子之一。

39、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

40、1.本发明提供的多肽能够特异性识别drp1蛋白，精准阻断drp1-acsl4相互作用，作用机制明确，能够有效穿透细胞膜进入细胞内部发挥作用。

41、2.本发明提供的多肽能够显著抑制牙龈卟啉单胞菌lps诱导的巨噬细胞炎症反应，抑制牙龈卟啉单胞菌lps诱导的巨噬细胞铁死亡，保护牙周组织细胞。