一种靶向TAM的GD2/CD47双靶点纳米复合物及其制备方法与应用

本发明属于医药，具体涉及一种靶向tam的gd2/cd47双靶点纳米复合物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、临床骨肉瘤治疗面临无法满足高效、特异、协同的需求，存在以下缺陷：（1）肿瘤相关巨噬细胞（tam）靶向性不足：传统脂质体纳米颗粒（lnp）或病毒载体缺乏对tam的特异性识别，导致递送效率低、脱靶效应明显。（2）单一靶点局限：单纯cd47抗体或gd2抗体仅阻断部分“别吃我”信号或adcc效应，无法全面逆转肿瘤微环境（tme）免疫抑制。（3）递送系统不协同：现有car-m或纳米药物难以同时实现基因编辑（car-sirpα）和抗体药物（αgd2）的共递送，且缺乏代谢重编程的正反馈机制。（4）临床转化瓶颈：缺乏体内原位tam基因编辑与多维度验证的组合物，导致疗效不稳定且易产生耐药。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种tam靶向肽，所述tam靶向肽的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述tam靶向肽能够使gd2/cd47双靶点纳米复合物转染至巨噬细胞中，提高转染效果。

2、本发明提供一种tam靶向肽，所述靶向肽的氨基酸序列如seq id no:2所示。

3、本发明提供一种gd2/cd47双靶点纳米复合物，所述纳米复合物的原料包括有机相、水相与αgd2抗体；

4、所述有机相包括dmg-peg-tam靶向肽，所述dmg-peg-tam靶向肽中的tam靶向肽为权利要求1所述tam靶向肽，所述dmg-peg-tam靶向肽是将tam靶向肽的n端氨基与dmg-peg的末端羧基发生缩合反应得到的；

5、所述水相包括car-sirpα质粒；所述car-sirpα质粒包含sirpα胞外结构域，所述sirpα胞外结构域的氨基酸序列如seq id no:3所示。

6、优选地，所述有机相还包括sm-102、dspc与胆固醇；所述水相还包括mtas-nls融合肽；所述mtas-nls融合肽的氨基酸序列如seq id no:9所示；

7、所述car-sirpα质粒的嵌合抗原受体还包括信号肽、cd8a铰链区、cd28跨膜与胞内信号区和cd3ζ胞内信号区。

8、优选地，所述sm-102、dmg-peg-tam靶向肽、dspc与胆固醇的摩尔比为50：（0.5~2）：（8~12）：（37~40）；

9、所述cd8a铰链区的氨基酸序列如seq id no:4所示、所述cd28跨膜与胞内信号区的氨基酸序列如seq id no:5所示；所述cd3ζ胞内信号区的氨基酸序列如seq id no:6所示；

10、所述信号肽的氨基酸序列如seq id no:10所示。

11、本发明提供一种上述纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

12、制备mtas-nls/pdna核复合物：将所述mtas-nls融合肽的溶液与所述car-sirpα质粒的溶液混合，进行孵育，得到mtas-nls/pdna核复合物；

13、制备tam靶向肽修饰的脂质体：将sm-102、dspc、胆固醇和所述tam靶向肽混合，得到tam靶向肽修饰的脂质体；

14、lnp@pdna的制备：以mtas-nls/pdna核复合物为水相，以所述tam靶向肽修饰的脂质体为有机相，将有机相和水相混合，得到lnp@pdna；

15、将所述lnp@pdna与αgd2抗体进行孵育，得到gd2/cd47双靶点纳米复合物。

16、优选地，制备mtas-nls/pdna核复合物时，mtas-nls融合肽的溶液的浓度为1~3mg/ml；car-sirpα质粒的溶液的浓度为0.5~2mg/ml；所述孵育的条件为在20~25℃孵育25~35min；所述mtas-nls融合肽的溶液与car-sirpα质粒的溶液的体积比为1:2~1:3；

17、制备tam靶向肽修饰的脂质体时，所述混合的方式为将sm-102、dspc、胆固醇和所述tam靶向肽混合按照摩尔比50：（8~12）：（37~40）：（0.5~2）混合；

18、lnp@pdna的制备时，所述水相的溶剂为ph4.0的柠檬酸盐缓冲液；所述有机相的溶剂为无水乙醇；

19、lnp@pdna与αgd2抗体进行孵育时，所述lnp@pdna溶液的浓度为0.5~2mg/ml，所述αgd2抗体的溶液的浓度为0.5~2mg/ml，所述lnp@pdna与αgd2抗体的体积为18~22：1，所述孵育的条件为在3~5℃孵育2~4h。

20、优选地，所述水相与有机相的体积流速比为2~4:1；所述水相与有机相的总流速为10~14ml/min。

21、本发明提供一种含有上述纳米复合物的巨噬细胞。

22、优选地，所述巨噬细胞包括m1型巨噬细胞和/或m2型巨噬细胞。

23、本发明提供一种上述纳米复合物与上述巨噬细胞在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

24、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

25、本发明提供了一种tam靶向肽、gd2/cd47双靶点纳米复合物及其制备方法与应用。所述tam靶向肽的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述tam靶向肽能够使gd2/cd47双靶点纳米复合物转染至巨噬细胞中，提高转染效果。所述纳米复合物为脂质纳米复合物（lnp），其表面修饰tam靶向肽。该纳米复合物通过“car-sirpα质粒引发tam基因编辑”与“αgd2抗体阻断/adcc效应”的双重协同作用，成功逆转了免疫抑制微环境，不仅极其显著地抑制了原位骨肉瘤的恶性生长（降低瘤重超过60%），还大幅度延长了患病动物的整体生存期。

1.一种tam靶向肽，其特征在于，所述靶向肽的氨基酸序列如seq id no:2所示。

2.一种gd2/cd47双靶点纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物的原料包括有机相、水相与αgd2抗体；

3.根据权利要求2所述gd2/cd47双靶点纳米复合物，其特征在于，所述有机相还包括sm-102、dspc与胆固醇；所述水相还包括mtas-nls融合肽；所述mtas-nls融合肽的氨基酸序列如seq id no:9所示；

4.根据权利要求3所述gd2/cd47双靶点纳米复合物，其特征在于，所述sm-102、dmg-peg-tam靶向肽、dspc与胆固醇的摩尔比为50：（0.5~2）：（8~12）：（37~40）；

5.权利要求1~4任一项所述纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，制备mtas-nls/pdna核复合物时，mtas-nls融合肽的溶液的浓度为1~3mg/ml；car-sirpα质粒的溶液的浓度为0.5~2mg/ml；所述孵育的条件为在20~25℃孵育25~35min；所述mtas-nls融合肽的溶液与car-sirpα质粒的溶液的体积比为1:2~1:3；

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述水相与有机相的体积流速比为2~4:1；所述水相与有机相的总流速为10~14ml/min。

8.一种含有gd2/cd47双靶点纳米复合物的巨噬细胞，其特征在于，所述gd2/cd47双靶点纳米复合物为权利要求2~4任一项所述的纳米复合物与权利要求5~7任意一项所述制备方法得到的纳米复合物。

9.根据权利要求8所述巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞包括m1型巨噬细胞和/或m2型巨噬细胞。

10.权利要求2~4任一项所述的纳米复合物、权利要求5~7任意一项所述制备方法得到的纳米复合物或权利要求8或9所述巨噬细胞在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。