用于抑制细胞内GPR146表达的核酸的制作方法

本发明涉及干扰或抑制g蛋白偶联受体146 (gpr146)基因表达的双链核酸分子。本发明进一步涉及此类抑制的治疗用途，诸如用于治疗gpr146介导的疾病、病症或综合征，诸如高脂血症、高胆固醇血症、杂合子家族性高胆固醇血症(hefh)、纯合子家族性高胆固醇血症(hofh)、常染色体隐性高胆固醇血症、动脉粥样硬化和/或动脉粥样硬化性心血管疾病。

背景技术：

1、能够通过互补碱基配对与表达的mrna结合的双链rna (dsrna)，已显示通过称为“rna干扰(rnai)”的机制阻断基因表达(fire等人，1998，nature. 1998年2月19日;391(6669):806-11和elbashir等人，2001，nature. 2001年5月24日;411(6836):494-8)。短的dsrna在许多生物体(包括脊椎动物)中指导基因特异性的转录后沉默，并已成为研究基因功能的有用工具。rnai由rna诱导沉默复合体(risc)介导，这是一种序列特异性的多组分核酸酶，其降解与装载至risc复合体中的沉默触发物具有足够互补性或同源性的信使rna。干扰rna诸如sirna、反义rna和微rna是通过基因沉默(即通过降解mrna分子抑制蛋白的基因翻译)来阻止蛋白形成的寡核苷酸。基因沉默剂在医学治疗应用中正变得越来越重要。

2、根据watts和corey在《病理学杂志》(journal of pathology)中发表的文章(2012年;第226卷,第365-379页)，存在可用于设计核酸沉默触发物的算法，但所有这些算法均具有严重的局限性。可能需要多种实验方法来鉴定有效的sirna，因为算法未考虑诸如靶mrna的三级结构或rna结合蛋白参与等因素。因此，发现具有最小脱靶效应的有效核酸沉默触发物是一个复杂的过程。对于这些高电荷分子的药物开发，以下是必需的：它们可以经济地合成、分布至靶组织、进入细胞并在可接受的毒性限度内发挥作用。

3、高胆固醇血症是心血管疾病的主要风险因素。对于患有动脉粥样硬化性心血管疾病的患者，降低胆固醇可以降低心血管死亡率。

4、gpr146是一种孤儿g蛋白偶联受体(gpcr)，其位于包括肝脏和脂肪组织在内的多种组织和器官的质膜中。gpcr通常通过gαs、gαi/o、gαq/11、gα12/13或gβ/γ进行信号传导，并调节camp水平、ca2+动员、erk/mapk活性或小g蛋白rhoa活性(cheng等人，2010. curr.chem. genomic. 12月21日:4:84-91)。gpr146显示促进肝细胞中的erk1/2信号传导级联，其继而增加srebp2活性和vldl分泌率，同时独立于ldl受体活性发挥作用(yu等人，2019.cell. 第179卷，第6期，p1276-1288)。对单核苷酸多态性的遗传变异测量显示，rs1997243是一种致病性变体，其增加gpr146表达，导致人类血液胆固醇升高。动物模型表明，gpr146主要通过肝脏参与胆固醇水平的调节，并且gpr146敲除小鼠具有降低的血液胆固醇和甘油三酯水平(han等人，2020. cell research. 30, 363-365)。

5、wo2021174056a1公开了针对gpr146的sirna，用于治疗gpr146相关病症，例如高胆固醇血症和动脉粥样硬化病症。

6、临床前机制研究指出，rna干扰介导的脱靶效应可能是galnac-sirna缀合物肝毒性的驱动因素。这些脱靶效应可由risc装载的sirna通过sirna引导链种子区(核苷酸2-8)与mrna的 3´-非翻译区中互补位点之间的碱基配对介导的与脱靶转录本的结合所驱动。这种非催化机制本质上模拟了内源性mirna的转录后沉默，并且可在risc装载的sirna的超药理学水平下导致翻译抑制和/或mrna去稳定化，其中mrna水平的降低占哺乳动物mirna介导的转录后抑制的大部分(66%至>90%)(schlegel等人，nucleic acid research 2022; 50(12), 6656-6670)。

7、因此，本发明的一个目的是提供用于治疗gpr146介导的疾病、病症或综合征(例如高脂血症、高胆固醇血症、杂合子家族性高胆固醇血症(hefh)、纯合子家族性高胆固醇血症(hofh)、常染色体隐性高胆固醇血症、动脉粥样硬化和/或动脉粥样硬化性心血管疾病)的有效且安全的化合物和(药物)组合物。

技术实现思路

1、本发明的一个方面是一种用于抑制g蛋白偶联受体146 (gpr146)表达的双链核酸，其中核酸包含第一链和第二链，其中第一链序列的未修饰对应序列包含至少15个核苷酸的序列，该序列与表5a、表1、表5b、表2或表5c中所示的任一第一链序列相差不超过3个核苷酸。

2、因此，本文描述的核酸是能够抑制gpr146表达(优选在细胞中抑制gpr146表达)的双链核酸，并且可用作治疗剂或诊断剂，例如分别在相关的治疗或诊断方法中用作治疗剂或诊断剂。

3、本发明的核酸包含第一链和第二链，或由第一链和第二链组成，并且第一链通常包含与gpr146 mrna足够互补的序列，以介导rna干扰。

4、一个方面涉及组合物，所述组合物包含本文公开的核酸和溶剂(优选水)和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂。

5、一个方面涉及组合物，所述组合物包含本文公开的核酸和治疗剂，所述治疗剂选自例如寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽。

6、一个方面涉及本文公开的核酸或包含所述核酸的组合物，用作治疗剂或诊断剂，例如在相关方法中用作治疗剂或诊断剂。

7、一个方面涉及本文公开的核酸或包含所述核酸的组合物，用于预防或治疗疾病、病症或综合征。

8、一个方面涉及本文公开的核酸或包含所述核酸的组合物在预防或治疗疾病、病症或综合征中的用途。

9、一个方面涉及本文公开的核酸或包含所述核酸的组合物在制备用于预防或治疗疾病、病症或综合征的药物中的用途。

10、一个方面涉及本文公开的组合物，用作药物。

11、一个方面涉及一种预防或治疗疾病、病症或综合征的方法，包括向需要治疗的受试者施用药学有效剂量或量的本文公开的核酸或组合物。优选地，核酸或组合物通过皮下、静脉内或通过口服、直肠、肺部、肌内或腹膜内施用施用至受试者。

1.一种用于抑制gpr146表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链，其中第一链序列的未修饰对应序列包含至少15个核苷酸的序列，所述序列与表5a、表1、表5b、表2或表5c中所示的任一第一链序列相差不超过3个核苷酸。

2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述第一链和所述第二链是分开的链，且各自长度为18-25个核苷酸。

3.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链和所述第二链形成长度为17-25个核苷酸的双链体区域。

4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链和所述第二链形成长度为19个核苷酸的双链体区域。

5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸：

6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸是sirna。

7.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸介导rna干扰。

8.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中：

9.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链的至少一个核苷酸是修饰的核苷酸，优选地其中所述修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸，诸如2'-f修饰的核苷酸。

10.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链的至少第2和14位核苷酸通过第一修饰进行修饰，核苷酸从第一链序列5'端的第1位核苷酸开始连续编号。

11.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链的每个偶数编号核苷酸通过第一修饰进行修饰，核苷酸从第一链序列5'端的第1位核苷酸开始连续编号。

12.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链的奇数编号核苷酸通过第二修饰进行修饰，其中所述第二修饰不同于所述第一修饰。

13.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第二链中对应于所述第一链偶数编号核苷酸的位置的核苷酸通过第三修饰进行修饰，其中所述第三修饰不同于所述第一修饰。

14.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第二链中对应于所述第一链奇数编号核苷酸的位置的核苷酸通过第四修饰进行修饰，其中当存在第二修饰和/或第三修饰时，所述第四修饰不同于所述第二修饰且不同于所述第三修饰。

15.根据权利要求1至12中任一项所述的核酸，其中所述第二链中对应于所述第一链第11位核苷酸或第13位核苷酸或第11和13位核苷酸或第11-13位核苷酸的位置的核苷酸通过第四修饰进行修饰，并且优选地其中所述第二链中未通过第四修饰进行修饰的核苷酸通过第三修饰进行修饰。

16.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中如果第一修饰与第四修饰存在于所述核酸中，则第一修饰与第四修饰相同，并且优选地其中如果第二修饰与第三修饰存在于所述核酸中，则第二修饰与第三修饰相同。

17.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中第一修饰为2'-f修饰；第二修饰如果存在于所述核酸中，则其优选为2'-ome修饰；第三修饰如果存在于所述核酸中，则其优选为2'-ome修饰；并且第四修饰如果存在于所述核酸中，则其优选为2'-f修饰。

18.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链和所述第二链的每个核苷酸均为修饰的核苷酸。

19.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链在其5'端具有末端5'-(e)-乙烯基膦酸酯核苷酸，并且任选地其中所述末端5'-(e)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选通过磷酸二酯键连接至所述第一链中的第二个核苷酸。

20.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸在第一链和/或第二链的末端两个或三个3'核苷酸和/或5'核苷酸之间包含硫代磷酸酯键，并且任选地其中剩余核苷酸之间的键为磷酸二酯键。

21.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸在第一链的末端三个3'核苷酸的各核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。

22.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸在第二链的末端三个3'核苷酸的各核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。

23.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，所述核酸包含在第一链3'端的两个、三个或四个末端核苷酸的各核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，和/或包含在第二链3'端的两个、三个或四个末端核苷酸的各核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，和/或在第二链5'端的两个、三个或四个末端核苷酸的各核苷酸之间的二硫代磷酸酯键，并且包含在第一链5'端的两个、三个或四个末端核苷酸之间的除二硫代磷酸酯键之外的键。

24.根据权利要求1-20中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含在第一链3'端的两个、三个或四个末端核苷酸的各核苷酸之间和/或在第一链5'端的两个、三个或四个末端核苷酸的各核苷酸之间，和/或在第二链3'端的两个、三个或四个末端核苷酸的各核苷酸之间，和/或在第二链5'端的两个、三个或四个末端核苷酸的各核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

25.根据权利要求20或权利要求24所述的核酸，其中除了所述第一链3'端的两个末端核苷酸之间的键以及所述第二链3'端和5'端的两个末端核苷酸之间的键之外，两条链的核苷酸之间的所有键均为磷酸二酯键。

26.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中：

27.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中：

28.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸缀合至异源部分。

29.根据权利要求28所述的核酸，其中所述异源部分包含(i)一个或更多个n-乙酰半乳糖胺(galnac)部分或其衍生物，和(ii)连接子，其中所述连接子将至少一个galnac部分或其衍生物缀合至所述核酸。

30.根据权利要求28或权利要求29所述的核酸，其中所述核酸缀合至包含式(ii)的化合物的异源部分：

31.根据权利要求28至30中任一项所述的核酸，其中所述核酸的第一链为式(v)的化合物：

32.根据权利要求28至31中任一项所述的核酸，所述核酸为表5c中所示具有给定双链体id no.的双链体之一。

33.一种组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项所述的核酸以及溶剂和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂。

34.根据权利要求33所述的组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项所述的核酸和治疗剂，所述治疗剂选自包含寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽的组。

35.前述权利要求中任一项所述的核酸或权利要求33或34所述的组合物，用作治疗剂。

36.权利要求1至32中任一项所述的核酸或权利要求33或34所述的组合物，用于在预防或治疗疾病、病症或综合征中使用。

37.根据权利要求36所述的用于使用的核酸或组合物，其中所述疾病、病症或综合征是gpr146介导的疾病、病症或综合征。

38.根据权利要求36或37所述的用于使用的核酸或组合物，其中所述疾病、病症或综合征与gpr146的异常激活或过度激活和/或gpr146的过表达或异位表达或定位或积累相关。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的用于使用的核酸或组合物，其中所述疾病、病症或综合征选自：

40.权利要求1至32中任一项所述的核酸或权利要求33或34所述的组合物在制备用于预防或治疗疾病、病症或综合征的药物中的用途。

41.一种预防或治疗疾病、病症或综合征的方法，包括向需要治疗的个体施用药学有效剂量的权利要求1至32中任一项所述的核酸或权利要求33或34所述的组合物，任选地其中所述核酸或组合物通过皮下、静脉内或通过口服、直肠或腹膜内施用施用至受试者。