一种靶向Col2a1的siRNA、其递送系统及应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种靶向col2a1的sirna、其递送系统及应用，该靶向col2a1的sirna能特异性阻断局部组织的col2a1信号，阻断其与下游细胞的病理通讯，进而恢复血管网络，改善局部免疫微环境，促进双膦酸盐相关颌骨坏死（bronj）的软组织与骨组织愈合。

背景技术：

1、双膦酸盐相关颌骨坏死（bronj）是抗骨吸收治疗（如用于治疗骨质疏松症和癌症骨转移的双膦酸盐药物）最严重的并发症之一。临床上，bronj表现为难以愈合的颌骨暴露和坏死，常伴有疼痛、感染及软组织损伤，甚至发展为病理性骨折和长期的颌骨功能障碍。目前，临床上针对bronj尚缺乏有效的治愈手段，常规治疗（如抗菌漱口水、全身使用抗生素、坏死骨切除及软组织闭合等）复发率极高，其主要原因在于局部血管修复功能的不可逆衰竭。

2、尽管血管生成受损已被认为是bronj发病的重要机制，但内皮细胞功能障碍的分子基础及其如何扰乱局部微环境仍未完全阐明。最新研究证实，双膦酸盐不仅直接导致血管网络的严重退化，更重要的是，在bronj微环境中，病理性的内皮细胞会通过异常上调其细胞内部的col2a1基因，通过col2a1-cd44/sdc4信号轴调控巨噬细胞和成纤维细胞，使下颌骨微环境中细胞外基质紊乱、炎症加重。

3、在此背景下，开发一种能够特异性沉默局部col2a1表达的核酸药物，有望从源头上阻断异常的细胞间通讯，恢复内皮功能，挽救bronj的病理表型，为bronj这一难治性疾病提供全新的靶向治疗策略。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中的不足，本发明的第一个目的在于提供一种靶向col2a1的sirna及其药学上可接受的制剂。该sirna能够特异性沉默靶细胞中的col2a1基因表达，从而切断col2a1-cd44/sdc4病理信号轴，抑制细胞外基质的异常重塑和局部炎症，为颌骨微环境的血管化与骨再生清除障碍。

2、本发明的第二个目的在于基于上述靶向col2a1的sirna在制备治疗双膦酸盐相关颌骨坏死（bronj）、促进颌骨血管生成、淋巴管生成和/或组织修复的药物中的应用。该策略打破了以往单纯“促进血管生成”的局限，从“内皮-成骨-免疫”三维微环境网络的调控入手，为bronj及其他局部微环境失衡相关疾病的临床干预提供了优化方案。

3、本发明的第三个目的在于提供一种包含上述靶向col2a1的sirna的递送系统，实现高效、原位药物释放。

4、为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。

5、在一方面，本发明提供了一种靶向col2a1的sirna或其药学上可接受的盐，所述sirna具有正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列为经修饰的如seq id no：1所示的核苷酸序列；所述反义链的核苷酸序列为经修饰的如seq id no：2所示的核苷酸序列；

6、所述修饰包括对核苷酸进行甲氧基修饰、硫代骨架修饰及胆固醇修饰；

7、所述甲氧基修饰，是按照5'端至3'端的方向，包括在正义链第1、2、3、6、8、9、11、12、15、16、17、18、22、23位置处的核苷酸糖环的2'位置进行甲氧基修饰（2'-o-甲基修饰）；按照5'端至3'端的方向，包括在反义链第1、2、3、8、9、12、15、17、18、22、23位置处的核苷酸糖环的2'位置进行甲氧基修饰（2'-o-甲基修饰）；

8、所述硫代骨架修饰，是按照5'端至3'端的方向，包括正义链第1~3位核苷酸之间和第21~23位核苷酸之间，相邻核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接；按照5'端至3'端的方向，包括反义链第1~3位核苷酸之间和第21~23位核苷酸之间，相邻核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接；

9、所述胆固醇修饰，是按照5'端至3'端的方向，包括在正义链第23位核苷酸糖环的3'位置进行胆固醇修饰。

10、在本文中，所述“药学上可接受的盐”是指本发明所提供靶向col2a1的sirna在药学上可接受的盐。通常地，本发明提到的“药学上可接受的盐”是指保留了靶向col2a1生物学活性且适合给药于人或动物的盐，且用于制备所述sirna的盐的方法在本技术领域中是已知的，通常包括将所述sirna与药学上可接受的碱或酸进行反应。

11、在其中一种技术方案中，经修饰的正义链核苷酸序列为：

12、5'-mcmcmuggmcamumugmcmuggmcmumumuaaamumu-3'-cholesteryl；

13、经修饰的反义链核苷酸序列为：

14、5'-mumumuaaagmcmcagmcaamugmcmcaggmumu-3'；

15、其中，mc、mu表示进行2'-o-甲基修饰的核苷酸；

16、表示相邻核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接；

17、3'-cholesteryl表示3'端进行胆固醇修饰。

18、在其中一种技术方案中，所述修饰还包括在正义链和/或反义链的3'端悬垂脱氧核糖核苷酸dtdt；或者，在正义链和/或反义链的3'端添加核糖核苷酸uu。

19、另一方面，本发明提供了一种包含上述靶向col2a1的sirna的递送系统，其含有上述靶向col2a1的sirna或其药学上可接受的盐。

20、在其中一种技术方案中，所述递送系统还包括递送载体，所述靶向col2a1的sirna或其药学上可接受的盐负载于所述递送载体中、或与所述递送载体混合、复合或偶联。

21、进一步地，所述递送载体优选包括水凝胶、脂质体、纳米粒或外泌体。

22、为了更好地说明本发明，并提供一种可供参考的优选技术方案中，所述递送载体为光交联甲基丙烯酰化明胶（gelma）水凝胶。具体地，负载有上述sirna的光交联甲基丙烯酰化明胶水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

23、（1）将光引发剂lap溶解于磷酸盐缓冲溶液（pbs缓冲液，0.01 m磷酸盐）中，配制得到0.25 w/v%的引发剂标准溶液；

24、（2）将甲基丙烯酰化明胶按照5~15 w/v%的比例溶于步骤（1）所得引发剂标准溶液中，混合均匀作为前驱体溶液；

25、（3）将100 μg靶向col2a1的sirna溶于0.2 ml前驱体溶液中，得到负载有sirna的前驱体溶液；

26、（4）将负载有sirna的前驱体溶液在405 nm光源下照射30 s，即得负载有sirna的光交联甲基丙烯酰化明胶水凝胶。

27、又一方面，本发明还涉及将上述靶向col2a1的sirna或其药学上可接受的盐、包含上述靶向col2a1的sirna的递送系统，在制备治疗双膦酸盐相关颌骨坏死（bronj）药物中的应用。

28、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

29、1、本发明提供了一种靶向col2a1的sirna，该sirna直接干预bronj病理过程中的核心枢纽分子col2a1，相比于传统的广谱抗炎或促血管药物，其特异性更高，从源头上阻断了病理性内皮-基质通讯。

30、2、本发明提供了一种包含上述靶向col2a1的sirna的递送系统，通过动物体内实验证实，局部应用负载该sirna的水凝胶，不仅能有效恢复血管的形态与功能，还能逆转基质细胞和免疫细胞的病理状态，促进成骨、缓解炎症，从而实现局部微环境的全面重塑。

31、3、在小鼠bronj拔牙缺损模型中证实，拔牙后立即原位应用负载sirna的gelma水凝胶，能显著加速软组织愈合并促进拔牙创内的骨再生，成功挽救bronj表型。

32、4、结合可光交联的gelma水凝胶递送系统，可实现拔牙创窝内的无缝填充与原位持续释放，操作简便，极具临床转化前景。