一种烟草内源多肽Nt1318及其应用的制作方法
本发明属于生物，具体涉及一种烟草内源多肽nt1318及其应用。
背景技术：
1、由尖孢镰刀菌侵染引起的根腐病是烟草规模化种植中普遍发生的重要土传病害，严重影响烟草的产量与品质，是造成烟农经济损失、制约烟草产业稳定发展的主要病害因素。当前生产中针对烟草根腐病的防控手段主要依赖化学农药，长期施用易导致病原菌产生耐药性，同时存在农药残留超标、生态环境污染等问题，无法适配绿色农业与可持续种植的发展需求，因此亟需研发一种高效、安全、绿色的新型防控技术方案。
2、植物诱抗剂主要包括化学合成化合物与生物制剂，其通过激活植物自身免疫体系提升植株抗病性，是现代农业病害绿色防控的核心技术手段。其中，植物内源分泌小肽为植物体内天然的信号分子，可参与调控植物生长发育及逆境应答过程，具备高效、广谱、环境友好的技术优势，是作物病害绿色防控的优质研发方向。
3、现有研究表明，植物分泌小肽是调控植物免疫应答的核心信号分子。在病原菌侵染过程中，植物可释放内源小肽至质外体，该小肽可被植物细胞表面受体特异性识别，进而激活下游系列免疫防御反应，实现对植株抗病性的调控。植物细胞表面受体不仅可识别病原菌分泌的外源异源分子触发免疫反应，还可通过识别植株自身释放的危险信号分子启动内源免疫调控，而植物分泌小肽在该内源抗病调控通路中起到关键调控作用。
4、目前，现有技术中尚未见利用烟草内源分泌小肽防控烟草根腐病的相关报道。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种烟草内源多肽nt1318及其应用。用于解决现有技术中缺少利用烟草内源分泌小肽防控烟草根腐病的问题。
2、在第一方面，本发明提供了一种烟草内源多肽nt1318，烟草内源多肽nt1318选自如下任一种：a1）氨基酸序列如seq id no.3所示；a2）与a1）限定的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列；a3）与a1）或a2）限定的氨基酸序列相比具有80%以上序列同一性的氨基酸序列；a4）在a1）或a2）或a3）限定的氨基酸序列的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的氨基酸序列。
3、本发明提供的上述烟草内源多肽nt1318可以是天然、重组或合成的活性多肽，该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主（例如大肠杆菌）或真核宿主（例如酵母、高等植物）中产生的产物。
4、本发明a4）中，连接可以通过肽键直接连接或通过接头连接，连接的方法为本领域常规的方法。其中，标签包括但不限于：gst（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白、trx（硫氧还蛋白）标签蛋白、his标签蛋白（his-tag）、flag标签蛋白、lacz标签蛋白、gfp（绿色荧光蛋白）、sfgfp（超折叠绿色荧光蛋白）、ha tag（血凝素标签）。本领域技术人员可以根据实际使用需要选择合适的标签蛋白。标签的使用不改变目的蛋白（烟草内源多肽nt1318）的功能，其目的在于分离、纯化、检测或示踪。标签可以通过本领域已知的化学裂解法或酶法（如引入蛋白酶切位点利用tev蛋白酶切割去除标签）与目的蛋白（烟草内源多肽nt1318）进行分离。
5、本发明中，发明人研究发现，该烟草内源多肽nt1318能诱导烟草ros爆发，激活植株基础免疫；同时，其能诱导烟草产生抗病性抵抗尖孢镰刀菌侵染，并且显著降低烟草尖孢镰刀菌根腐病病情指数，对烟草尖孢镰刀菌根腐病具有较好的防治效果；因此，该烟草内源多肽nt1318在烟草尖孢镰刀菌根腐病的防治中具有较好的应用前景。
6、进一步地，烟草内源多肽nt1318包含高度保守yisy核心功能位点，该位点是识别烟草fer受体、诱导质外体快速碱化、启动ros免疫爆发的必需识别元件；同时，该烟草内源多肽nt1318含4个保守半胱氨酸，形成分子内二硫键维持多肽空间构象，保障诱抗活性。
7、在一些实施方案中，上述烟草内源多肽nt1318是通过将含有其编码基因的重组载体导入表达宿主（例如e .coli bl21(de3)）中得到重组基因工程菌株，然后将该重组基因工程菌株进行培养，并进行诱导表达，得到烟草内源多肽nt1318。
8、在第二方面，本发明提供了编码上述烟草内源多肽nt1318的核酸分子。
9、本发明提供的上述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；也可以是rna，如mrna或hnrna等；并且该核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。
10、在一些实施方案中，核酸分子选自如下任一种：b1）具有如seq id no.4所示的核苷酸序列的核酸分子；b2）与b1）限定的核酸分子杂交且编码上述烟草内源多肽nt1318的核酸分子；b3）与b1）或b2）限定的核酸分子具有90%以上的序列同一性且编码上述烟草内源多肽nt1318的核酸分子。
11、如本文所用，术语“在严格条件下杂交”是指两个核酸分子片段在如sambrook等的分子克隆：实验手册(1989)(冷泉巷实验室出版，纽约，美国)的“大肠杆菌中克隆基因的表达”一节里所述的标准杂交条件下互相杂交。这样的条件如在45℃的6.0×ssc中杂交，然后在50℃的2×ssc中进行洗涤的步骤。为了选择严格性，可以例如在用于低严格性的50℃下的2.0×ssc和用于高严格性50℃下的2.0×ssc之间选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，洗涤步骤中温度可在用于低严格性的约22℃的室温和用于高严格性的65℃之间变化。
12、如本文所用，术语“序列同一性”可以用肉眼或计算机软件（比如ausubel et al.eds.（2007）在current protocols in molecular biology中所述的软件程序）进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列具有一定百分比（例如90%、95%、98%或者99%）的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。
13、在第三方面，本发明提供了一种重组载体，包含上述核酸分子。
14、本发明提供的重组载体包括克隆载体和表达载体，克隆载体用于复制相关序列，表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以为pet-26b(+)、pet28a、pet23a、pet-32a载体中的至少一种；本发明中，表达载体优选为pet-32a载体。
15、在第四方面，本发明提供了一种重组细胞，包含上述核酸分子或上述重组载体。
16、在一些实施方案中，重组细胞的制备方法包括将上述重组载体转化至表达宿主细胞中的步骤。
17、本发明中，表达宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组载体可稳定地自行复制，并且其所携带的基因可被有效表达即可，可以为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，大肠杆菌例如可以为e.coli bl21(de3)、rosetta(de3)、bl21(de3)plyss，本发明中，优选大肠杆菌表达宿主e.coli bl21(de3)。
18、在第五方面，本发明提供了一种烟草内源多肽nt1318的制备方法，包括如下步骤：对上述重组细胞进行培养，经诱导表达，得到培养物；从培养物中分离上述烟草内源多肽nt1318。
19、本发明中，培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组细胞正常生长即可。并且从培养物中分离出上述烟草内源多肽nt1318的方法均是本领域的常规方法。
20、在一些实施方案中，烟草内源多肽nt1318的制备方法中所使用的培养基是本领域内可表达蛋白质的培养基，优选lb培养基。
21、在第六方面，本发明提供了一种免疫诱抗制剂，包括上述烟草内源多肽nt1318。
22、在一些实施方案中，免疫诱抗制剂还包括辅料。
23、本发明中，辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的组合物，还可以提供方法，使活性成分以所期望的速率溶出，或促进植物接受组合物后活性成分得到有效吸收。辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体ph值或防止组合物活性成分的降解。辅料可以包括下列辅料中的一种或多种：粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂、填充剂、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。
24、本发明提供的免疫诱抗制剂可根据公开的内容使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，包括但不限于常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋或冻干工艺。
25、在一些实施方案中，免疫诱抗制剂的剂型包括固体制剂、半固体制剂、液体制剂中的至少一种。
26、在一些实施方案中，固体制剂包括片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、栓剂中的至少一种；半固体制剂包括软膏剂、乳膏剂、贴剂中的至少一种；液体制剂包括注射剂、口服液、糖浆剂、吸入剂中的至少一种。
27、在第七方面，本发明提供了如上述烟草内源多肽nt1318、上述任一项核酸分子、上述重组载体、上述重组细胞、上述制备方法制备得到的烟草内源多肽nt1318或者上述免疫诱抗制剂在植物根腐病防治中的应用。
28、在一些实施方案中，植物根腐病是由尖孢镰刀菌引起的。
29、可以理解的是，引起植物根腐病的真菌病害病原菌可以为现有技术中常规的真菌病害病原菌，只要能引起植物根腐病即可。例如本发明中，植物根腐病优选由尖孢镰刀菌引起。
30、在一些实施方案中，植物包括烟草。
31、可以理解的是，植物可以为现有技术中常规的植物，本发明中，植物优选包括烟草。
32、本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明提供的烟草内源多肽nt1318能诱导烟草ros爆发，激活植株基础免疫；同时，其能诱导烟草产生抗病性抵抗尖孢镰刀菌侵染，并且显著降低烟草尖孢镰刀菌根腐病病情指数，对烟草尖孢镰刀菌根腐病具有较好的防治效果；因此，该烟草内源多肽nt1318在烟草尖孢镰刀菌根腐病的防治中具有较好的应用前景。