一种利用葡萄糖无细胞生物合成缬氨霉素的方法

本发明涉及生物，特别是涉及一种利用葡萄糖无细胞生物合成缬氨霉素的方法。

背景技术：

1、缬氨霉素(valinomycin)是一种非核糖体肽(nonribosomal peptide,nrp)类天然产物，它最初由brockmann和schmidt-kastner从富氏链霉菌(mycobacteriumtuberculosis)中分离和表征出来。作为一种主要由链霉菌来源的典型nrp类天然产物，缬氨霉素的生物合成主要依赖两个大分子量的非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptidesynthetase,nrps)vlm1和vlm2催化。vlm1和vlm2的工作机制具有典型nrps催化的特点，它们以丙酮酸(pyruvate)、α-酮异戊酸(α-keto-isovalerate)和l-缬氨酸(l-valine)为前体，经过三轮催化反应，最终聚合环化，形成36元环十二烷肽缬氨霉素。

2、尽管体外无细胞生物合成系统在近几年来被广泛用于一些通过廉价底物(如淀粉、纤维素等)获得有价值的化学品的生产中，但是使用结构简单、廉价易得的原始底物(如葡萄糖)来合成像聚酮(polyketides，pks)、nprs这种结构复杂的具有药用价值的天然产物的报道还是非常少见。目前，关于pks、nprs类化合物的异源表达的报道中，只有少数能够完成体外的部分或全合成，而且这些合成过程都需要添加非源性氨基酸、乙酰辅酶a、硫酯等单体构建模块。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种利用葡萄糖无细胞生物合成缬氨霉素的方法，用于解决现有技术中的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明首先提供一种无细胞生物合成缬氨霉素的多酶催化体系，所述催化体系包括葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,gdh)、二羟酸脱水酶(dehydratase,dht)、2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶(2-keto-3-desoxy gluconatealdolase,kdga)、甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde dehydrogenase,aldh)、乙酰羟酸合酶i(acetohydroxy acid synthase i,ahas i)、乙酰羟酸还原异构酶(acetohydroxy acidisomeroreductase,ahair)、二羟酸脱水酶(dihydroxy acid dehydratase,dhad)、支链氨基酸转移酶(branched-chain amino acid aminotransferase,bcat)、缬氨霉素合成酶1(valinomycin synthetase 1,vlm1)和缬氨霉素合成酶2(valinomycin synthetase 2,vlm2)。

3、本发明还提供一种利用葡萄糖无细胞生物合成缬氨霉素的方法，所述方法以d-葡萄糖(d-glucose)为底物，利用上述的多酶催化体系合成缬氨霉素。

4、如上所述，本发明的一种利用葡萄糖无细胞生物合成缬氨霉素的方法，具有以下有益效果：

5、1)该方法利用无细胞生物合成系统，避免了细胞内复杂代谢网络的干扰，提高了合成效率，降低了生产成本；

6、2)通过将合成过程分为三个模块(糖酵解通路、l-缬氨酸生物合成通路、缬氨霉素生物合成通路)，可以灵活调整各模块的反应条件，优化整个合成过程；

7、3)通过优化各酶的反应条件，如温度、底物浓度、反应时间等，显著提高了合成效率和产物纯度；

8、4)缬氨霉素具有重要的药用价值，本发明中所述的合成方法为大规模生产缬氨霉素提供了可能，具有潜在的工业应用价值。

1.一种无细胞生物合成缬氨霉素的多酶催化体系，其特征在于，所述多酶催化体系包括葡萄糖脱氢酶gdh、二羟酸脱水酶dht、2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶kdga、甘油醛脱氢酶aldh、乙酰羟酸合酶i ahas i、乙酰羟酸还原异构酶ahair、二羟酸脱水酶dhad、支链氨基酸转移酶bcat、缬氨霉素合成酶1vlm1和缬氨霉素合成酶2vlm2。

2.根据权利要求1所述的多酶催化体系，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶gdh的氨基酸序列如seq id no.1所示；优选的，所述葡萄糖脱氢酶gdh的编码基因的登录号为aak43106.1；

3.根据权利要求1所述的多酶催化体系，其特征在于，所述多酶催化体系中还包括辅酶nad+和/或nadph。

4.根据权利要求1所述的多酶催化体系，其特征在于，所述多酶催化体系中的各种酶来源于产酶的重组基因工程菌的培养物，或通过离心所述培养物获得的菌体细胞，或其加工制品；优选的，所述的产各种酶的重组基因工程菌所用的载体为pet系列质粒；优选的，所述的产各种酶的重组基因工程菌选自大肠杆菌bl21系列。

5.一种利用葡萄糖无细胞生物合成缬氨霉素的方法，其特征在于，所述方法以葡萄糖为底物，利用权利要求1中所述的多酶催化体系合成缬氨霉素。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括将葡萄糖经糖酵解通路转化为丙酮酸、将丙酮酸经l-缬氨酸生物合成通路转化为l-缬氨酸以及将l-缬氨酸、丙酮酸和α-酮异戊酸经缬氨霉素生物合成通路转化为缬氨霉素。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述糖酵解通路由葡萄糖脱氢酶gdh、二羟酸脱水酶dht、2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶kdga和甘油醛脱氢酶aldh参与葡萄糖转化为丙酮酸；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述糖酵解通路中包括以下特征中的任一项或多项：

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述l-缬氨酸的生物合成通路包括以下特征中的任一项或多项：

10.权利要求1～4中任一所述的多酶催化体系或权利要求5～9中任一所述的方法在在缬氨霉素合成中的应用。