中性低聚糖的合成方法

本发明属于低聚糖，具体来说涉及lnnt(乳-n-新四糖)和lnt(乳-n-四糖)的制备。

背景技术：

1、人乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大组成成分，通常由3-20个单糖单元组成。研究表明，hmos具有重要的生物学功能，不仅对肠道病原微生物起到抗感染的作用，还能维持肠道微生态平衡，调节婴幼儿免疫力，预防坏死性小肠结肠炎，促进大脑发育，等等。

2、经过多年的发展，婴幼儿奶粉行业最近革命性地推出了模拟母乳的新配方奶粉-人乳寡糖配方奶粉。雅培和雀巢两大奶粉巨头分别在2016年、2017年推出hmos配方婴幼儿奶粉，抢占市场先机。

3、研究证实lnt、lnnt具有抗炎、2型免疫反应诱导、诱导血管生成和抗菌、改善肠道菌群、改善肠易激综合症、降低食物致敏风险等功能。2018年1月12日，澳新食品标准局发布了a1115号通报，拟批准乳-n-新四糖(lnnt)作为新型食品原料用于婴幼儿配方食品和其它食品中。2023年10月7日，lnnt作为新食品营养强化剂在国内获批。

4、合成是获得寡糖的最有效途径。寡糖的合成方法主要有化学法、酶法和代谢工程或细胞工厂法。和化学法制备寡糖相比，酶法具有选择性好、工艺简单、反应条件温和、环境友好等优点；和代谢工程(或细胞工厂)方法制备寡糖相比，酶法具有产量高、速率快、产物易分离、反应条件宽泛等特点，因此，酶法制备寡糖，尤其一锅多酶(one-pot multienzyme，opme)法，越来越受到重视。然而，目前opme体系都使用了价格昂贵的三磷酸核苷(ntp)作为原料，不适合用于lnt、lnnt的商业化生成。并且上述方法基本均存在效率和或收率和或产率和或转化率不理想的问题。

技术实现思路

1、要解决的问题

2、本发明的目的之一在于提供lnt或者lnnt的制备方法，该方法有助于降低lnt或者lnnt的生产成本。

3、技术方案

4、为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

5、根据本发明的目的，本发明第一方面提供一种中性低聚糖的合成方法，包括使n-乙酰氨基葡萄糖、乳糖、半乳糖，在多酶催化的作用下生成中性低聚糖，包括：

6、(ⅰ)使n-乙酰氨基葡萄糖、乳糖在酶的催化及磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸作用下生成lnt ii；

7、(ⅱ)使lnt ii、半乳糖在酶的催化及磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸作用下生成中性低聚糖；

8、其中，所述的中性低聚糖为乳-n-新四糖或者乳-n-四糖。

9、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅰ)中的酶包括焦磷酸酶、聚磷酸激酶、β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-1-激酶、n-乙酰氨基葡萄糖尿苷酰转移酶。

10、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅱ)中的酶包括焦磷酸酶、聚磷酸激酶、半乳糖激酶、udp-糖焦磷酸化酶、β-半乳糖基转移酶。

11、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述β-半乳糖基转移酶为β-1,4-半乳糖基转移酶或者β-1,3-半乳糖基转移酶。

12、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述n-乙酰氨基葡萄糖、乳糖、半乳糖的质量比为(10～30)：(20～35)：(10～20)；优选质量比为(15～20)：(25～30)：(10～20)。

13、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅰ)中，焦磷酸酶、聚磷酸激酶、β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-1-激酶、n-乙酰氨基葡萄糖尿苷酰转移酶的质量比为(1～2)：(2～4)：(4～8)：(5～10)：(5～10)；优选质量比为(1～2)：(2～4)：(4～6)：(5～7)：(5～7)。

14、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅰ)中，n-乙酰氨基葡萄糖、与磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸的质量比为(1～5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选质量比为(1～3)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)。

15、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述n-乙酰氨基葡萄糖与β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶的质量比为(20～40)：1；优选质量比为(20～25)：1。

16、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅱ)中，焦磷酸酶、聚磷酸激酶、半乳糖激酶、udp-糖焦磷酸化酶、β-半乳糖基转移酶的质量用量比为(1～2)：(2～4)：(5～10)：(5～10)：(5～10)；优选质量比为(1～2)：(2～4)：(5～7)：(5～7)：(5～7)；

17、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅱ)中，半乳糖、与磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸的质量比为(1～5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选质量比为(1～3)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)。

18、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述半乳糖与β-半乳糖基转移酶的质量比为(10～20)：1；优选质量比为(12～16)：1。

19、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括缓冲液，所述缓冲液的作用之一是作为原料的配置溶剂、及制备过程的反应介质。

20、基于此，所述缓冲液包括但不限于tris-hcl、三乙醇胺-hcl、巴比妥钠-hcl、磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸盐、britton-robinson(br)、甘氨酸-氢氧化钠等缓冲溶液中的任意一种或者几种。

21、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述缓冲液具有7.0-9.5的ph值。

22、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括金属无机盐，按照金属离子所述金属离子包括但不限于co2+、mn2+、mg2+、ni2+、ca2+、zn2+、cd2+中的任意一种或者几种；基于次，所述金属无机盐可以举出例如mgcl2、gacl2、mncl2。

23、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅰ)中，n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)、无机盐的质量比为(1～3)：1；优选质量比为(2～2.5)：1。

24、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅱ)中，半乳糖(gal)、无机盐的质量比为(1～3)：1；优选质量比为(1.5～2)：1。

25、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括偏六磷酸钠。

26、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅰ)中，n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)与偏六磷酸钠的质量比为1：(1～3)；优选质量比为1：(1～2)。

27、根据本发明第一方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述(ⅱ)中，所述半乳糖(gal)与偏六磷酸钠的质量比为1：(1～3)；优选质量比为1：(1.5～2)。

28、基于本发明第一方面提供的中性低聚糖的合成方法，本发明第二方面提供一种合成中性低聚糖的具体方法，包括步骤：

29、sa1.配置含有n-乙酰氨基葡萄糖、乳糖、半乳糖、焦磷酸酶、聚磷酸激酶、β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-1-激酶、n-乙酰氨基葡萄糖尿苷酰转移酶、半乳糖激酶、udp-糖焦磷酸化酶、β-半乳糖基转移酶、磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸的混合液；

30、其中，所述n-乙酰氨基葡萄糖的初始浓度为1～10mg/ml；

31、所述lgta(β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶)的初始浓度为0.05～0.5mg/ml；

32、所述焦磷酸酶为(ⅰ)、(ⅱ)合计所需量；聚磷酸激酶为(ⅰ)、(ⅱ)合计所需量；磷酸腺苷为(ⅰ)、(ⅱ)合计所需量；尿苷5’-一三磷酸为(ⅰ)、(ⅱ)合计所需量；

33、sa2.于25～35℃下反应35～45h，期间进行振荡处理；

34、sa3.蛋白质灭活、分离产物。

35、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述β-半乳糖基转移酶为β-1,4-半乳糖基转移酶或者β-1,3-半乳糖基转移酶。

36、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sa1中，所述n-乙酰氨基葡萄糖、乳糖、半乳糖的质量比为(10～30)：(20～35)：(10～20)；优选质量比为(15～20)：(25～30)：(10～20)。

37、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sa1中，n-乙酰氨基葡萄糖、磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸的质量比为(1～5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选质量比为(1～3)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)。

38、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sa1中，焦磷酸酶、聚磷酸激酶、β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-1-激酶、n-乙酰氨基葡萄糖尿苷酰转移酶、半乳糖激酶、udp-糖焦磷酸化酶、β-半乳糖基转移酶的质量比为(1～2)：(2～4)：(2～4)：(2～5)：(2～5)：(2～5)：(2～5)：(2～5)。

39、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述n-乙酰氨基葡萄糖与β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶的质量比为(20～40)：1；优选质量比为(20～25)：1。

40、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括缓冲液，所述缓冲液的作用之一是作为原料的配置溶剂、及制备过程的反应介质。

41、基于此，所述缓冲液包括但不限于tris-hcl、三乙醇胺-hcl、巴比妥钠-hcl、磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸盐、britton-robinson(br)、甘氨酸-氢氧化钠等缓冲溶液中的任意一种或者几种。

42、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述缓冲液具有7.0-9.5的ph值。

43、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括金属无机盐，按照金属离子所述金属离子包括但不限于co2+、mn2+、mg2+、ni2+、ca2+、zn2+、cd2+中的任意一种或者几种；基于次，所述金属无机盐可以举出例如mgcl2、gacl2、mncl2。

44、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sa1中，n-乙酰氨基葡萄糖、无机盐的质量比为(0.5～1.5)：1；优选质量比为(0.8～1.2)：1。

45、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括偏六磷酸钠。

46、根据本发明第二方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sa1中，n-乙酰氨基葡萄糖与偏六磷酸钠的质量比为1：(1～4)；优选质量比为1：(2.5～3)。

47、基于本发明第一方面提供的中性低聚糖的合成方法，本发明第三方面提供另外一种合成中性低聚糖的具体方法，包括步骤：

48、sb1.按照(ⅰ)中的配比及量要求，配置含有n-乙酰氨基葡萄糖、乳糖、焦磷酸酶、聚磷酸激酶、β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-1-激酶、n-乙酰氨基葡萄糖尿苷酰转移酶、磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸的混合液；

49、其中，所述n-乙酰氨基葡萄糖的初始浓度为1～10mg/ml；

50、所述β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶的初始浓度为0.05～0.15mg/ml初始浓度为0.05～0.5mg/ml；

51、sb2.于25～35℃下反应20～30h，期间进行振荡处理；

52、sb3.按照(ⅱ)中的配比及量要求，继续加入相应量的半乳糖、磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸以及焦磷酸酶、聚磷酸激酶、半乳糖激酶、udp-糖焦磷酸化酶、β-半乳糖基转移酶的酶液；

53、其中，所述半乳糖的初始浓度为1～7mg/ml；

54、所述β-半乳糖基转移酶的初始浓度为0.05～0.5mg/ml；

55、sb4.于25～35℃下反应20～30h，期间进行振荡处理；

56、sb5.蛋白质灭活、分离产物。

57、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述β-半乳糖基转移酶为β-1,4-半乳糖基转移酶或者β-1,3-半乳糖基转移酶。

58、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述n-乙酰氨基葡萄糖、乳糖、半乳糖的质量比为(10～30)：(20～35)：(10～20)；优选质量比为(15～20)：(25～30)：(10～20)。

59、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb1中，焦磷酸酶、聚磷酸激酶、β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-1-激酶、n-乙酰氨基葡萄糖尿苷酰转移酶的质量比为(1～2)：(2～4)：(4～8)：(5～10)：(5～10)；优选质量比为(1～2)：(2～4)：(4～6)：(5～7)：(5～7)。

60、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb1中，n-乙酰氨基葡萄糖、与磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸的质量比为(1～5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选质量比为(1～3)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)。

61、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb1中，n-乙酰氨基葡萄糖与β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶的质量比为(20～40)：1；优选质量比为(20～25)：1。

62、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb3中，焦磷酸酶、聚磷酸激酶、半乳糖激酶、udp-糖焦磷酸化酶、β-半乳糖基转移酶的质量用量比为(1～2)：(2～4)：(5～10)：(5～10)：(5～10)；优选质量比为(1～2)：(2～4)：(5～7)：(5～7)：(5～7)；

63、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb3中，半乳糖、与磷酸腺苷、尿苷5’-一三磷酸的质量比为(1～5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选质量比为(1～3)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)。

64、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb3中，半乳糖与β-半乳糖基转移酶的质量比为(10～20)：1；优选质量比为(12～16)：1。

65、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括缓冲液，所述缓冲液的作用之一是作为原料的配置溶剂、及制备过程的反应介质。

66、基于此，所述缓冲液包括但不限于tris-hcl、三乙醇胺-hcl、巴比妥钠-hcl、磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸盐、britton-robinson(br)、甘氨酸-氢氧化钠等缓冲溶液中的任意一种或者几种。

67、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述缓冲液具有7.0-9.5的ph值。

68、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括金属无机盐，按照金属离子所述金属离子包括但不限于co2+、mn2+、mg2+、ni2+、ca2+、zn2+、cd2+中的任意一种或者几种；基于次，所述金属无机盐可以举出例如mgcl2、gacl2、mncl2。

69、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb1中，n-乙酰氨基葡萄糖、无机盐的质量比为(1～3)：1；优选质量比为(2～2.5)：1。

70、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb3中，半乳糖、无机盐的质量比为(1～3)：1；优选质量比为(1.5～2)：1。

71、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述中性低聚糖的合成还包括偏六磷酸钠。

72、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb1中，n-乙酰氨基葡萄糖与偏六磷酸钠的质量比为1：(1～3)；优选质量比为1：(1～2)。

73、根据本发明第三方面任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述sb3中，所述半乳糖与偏六磷酸钠的质量比为1：(1～3)；优选质量比为1：(1.5～2)。

74、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的焦磷酸酶(ec 3.6.1.1)的来源包括但不限于acidithiobacillus thiooxidans，amaranthusblitum，amaranthus blitum，anabaena sp.strain pcc 7120，aquifex aeolicus，arabidopsis thaliana，aranda christine，ascaris suum，aspergillus oryzae，bacillus subtilis，blastochloris viridis，bacteroides thetaiotaomicron，bostaurus，caenorhabditis elegans，candidatus korarchaeum cryptofilum，capsicumannuum，catharanthus roseus，cereibacter sphaeroides，chlamydomonas reinhardtii，clostridium perfringens，desulfitobacterium hafniense，desulfovibriodesulfuricans，dunaliella salina，entamoeba histolytica，enterococcus faecalis，enterococcus faecium，escherichia coli，ethanoligenens harbinense，eutremahalophilum，gallus gallus，geobacillus stearothermophilus，gossypium hirsutum，haloferax volcani，helicobacter pylori，hordeum vulgare subsp.vulgare，hypophthalmichthys nobilis，kitasatospora aureofaciens，leishmania major，malusdomestica，medicago truncatula，methanothermobacter thermautotrophicus，methanothrix thermoacetophila，moorella thermoacetica，mus musculus，mus sp.，mycobacterium tuberculosis，mycoplasma suis，oryctolagus cuniculus，oryzasativa，papaver rhoeas，phaseolus vulgaris，plasmodium falciparum，priestiamegaterium，pseudanabaena sp.，pyrococcusfuriosus，pyrococcus horikoshii，rattusnorvegicus，rhipicephalus microplus，rhodobacter capsulatus，rhodopseudomonaspalustris，rhodospirillum rubrum，rubrivivax gelatinosus，saccharomycescerevisiae，saccharum officinarum，schizophyllum commune，shewanella sp.，solanumtuberosum，sorghum bicolor，spinacia oleracea，staphylococcus aureus，streptococcus agalactiae，streptococcus gordonii，streptococcus mutans，streptococcus salivarius，sulfolobus acidocaldarius，sulfolobus sp.，sulfurisphaera tokodaii，sus scrofa，synechocystis sp.，thermococcus onnurineus，thermococcus thioreducens，thermoplasma acidophilum，thermotoga maritima，thermus thermophilus，toxoplasma gondii，tribolium castaneum，trypanosoma cruzi，vibrio cholerae serotype o1，vigna radiata，vitis vinifera，zea mays中的任意一种或者几种。

75、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的聚磷酸激酶(ec 2.7.4.1和ec 2.7.4.b7)的来源包括但不限于achromobacterbutyri，acinetobacter baylyi adp1，acinetobacter johnsonii，alcaligenes faecalis，agrobacterium tumefaciens,arthrobacter sp.，bacillus anthracis，bacilluscereus，bacillus subtilis，burkholderia cepacia，burkholderia pseudomallei，campylobacter jejuni，chlamydomonas sp.，clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus，corynebacterium ammoniagenes，corynebacterium glutamicum，corynebacterium xerosis，cupriavidus necator，cupriavidusmetallidurans，cytophagahutchinsonii，deinococcusgeothermalis，deinococcusproteolyticus，deinococcusradiodurans，delftiatsuruhatensis，dictyostelium discoideum，escherichia coli，francisella tularensis，francisella tularensissubsp.holarctica，glomus sp.，helicobacter pylori，hydrogenophilaceae bacterium，klebsiella aerogenes，komagataeibacter xylinus，leishmania donovani，limnothrixredekei，lysinibacillus sphaericus，meiothermusruber，meiothermussilvanus，methanocorpusculum labreanum，micrococcus flavus，micrococcus luteus，microcystis aeruginosa，mycobacterium smegmatis，mycobacterium tuberculosis，myxococcus xanthus，neisseria gonorrhoeae，neisseria meningitidis，neopyropiayezoensis，nicotiana tabacum，nocardioides dokdonensis，oryza sativa japonicagroup，ostreococcus sp.'lucimarinus'，ostreococcus tauri，paenarthrobacteraurescens，physcomitrium patens，porphyromonas gingivalis，propionibacteriumfreudenreichii subsp.shermanii，proteus mirabilis，pseudomonas aeruginosa，pseudomonas chlororaphis，pseudomonas fluorescens，pseudomonas sp.b4，pyropiayezoensis，ralstoniaeutropha，rhodocyclus sp.，ruegeriapomeroyi，saccharomycescerevisiae，salmonella enterica，salmonella enterica subsp.enterica serovarminnesota，salmonella enterica subsp.enterica serovar typhimurium，serratiamarcescens，sinomonas atrocyaneasinomonas atrocyanea，sinorhizobiummeliloti,streptomyces lividans，sulfolobus acidocaldarius，thermosynechococcusvestitus，thermus thermophilus，vibrio cholerae serotype o1，[brevibacterium]flavum中的任意一种或者几种。

76、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶(ec 2.4.1.149)的来源包括但不限于bos taurus、cricetulusgriseus、haemophilus influenza、helicobacter pylori、homo sapiens、mus musculus、neisseria meningitidis、neisseria gonorrhoeae、rattus norvegicus中的任意一种或者几种。

77、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的n-乙酰氨基葡萄糖-1-激酶(ec 2.7.1.162)的来源包括但不限于bifidobacterium longum、bifidobacterium longum subsp.infantis、bifidobacterium longum subsp.longum、escherichia coli中的任意一种或者几种。

78、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的n-乙酰氨基葡萄糖尿苷酰转移酶(glmu)(ec 2.7.7.23)的来源包括但不限于arabidopsisthaliana、bombyx mori、bos taurus、candida albicans、drosophila melanogaster、entamoeba histolytica、escherichia coli、giardia intestinalis、haemophilusinfluenzae、homo sapiens、lepeophtheirussalmonis、leptinotarsa decemlineata、locusta migratoria、moniliophthoraperniciosa、mycobacterium tuberculosis、neisseria gonorrheae、neurospora crassa、oryza sativa japonica group、ovisaries、saccaromyces cerevisiae、staphylococcus aureus、streptococcus pneumoniae、sulfurisphaeratokodaii、sus scrofa、triboliumcastaneum、trypanosoma brucei、xanthomonas oryzae pv.oryzae、yersinia pseudotuberculosis中的任意一种或者几种。

79、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的半乳糖激酶(ec 2.7.1.6)的来源包括但不限于akkermansia muciniphila、arabidopsisthaliana、bifidobacterium bifidum、bifidobacterium longum subsp.infantis、canislupus familiaris、cricetulus griseus、escherichia coli、homo sapiens、musmusculus、lactococcus lactis、leminorella grimontii、mycobacterium sp.、pyrococcus furiosus、pyrococcus horikoshii、rattus norvegicus、saccharomycescerevisiae、streptococcus pneumoniae、streptococcus salivarius、streptococcusthermophilus、streptomyces coelicolor、sus scrofa、trichoderma reesei、trypanosoma cruzi、vicia faba、vigna radiata var.radiata的任意一种或者几种。

80、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的udp-糖焦磷酸化酶(ec 2.7.7.64和ec 2.7.7.44)的来源包括但不限于arabidopsis thaliana、bifidobacterium longum、candida albicans、catharanthus roseus、cucumis melo、escherichia coli、giardia intestinalis、glycine max、haemophilus influenzae、homosapiens、hordeum vulgare、hordeum vulgare subsp.vulgare、leishmania major、moniliophthora perniciosa、mycobacterium tuberculosis、neisseria gonorrhoeae、neurospora crassa、pasteurella multocida、pisum sativum、populus deltoides、saccharomyces cerevisiae、staphylococcus aureus、streptococcus pneumoniae、sulfurisphaera tokodaii、thermus caldophilus、trypanosoma cruzi、typhalatifolia、typha latifolia linne、xanthomonas oryzae pv.oryzae、yersiniapseudotuberculosis中的任意一种或者几种。

81、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的β-1,4-半乳糖基转移酶(ec 2.4.1.22)的来源包括但不限于aggregatibacteractinomycetemcomitans、aggregatibacteraphrophilus、arctocephalus pusillus pusillus、arctocephalus tropicalis、bos indicus、bos taurus、callorhinus ursinus、caprahircus、cavia porcellus、helicobacter pylori、histophilussomni、homo sapiens、leptonychotesweddellii、mammalia、mus musculus、neisseria meningitidis、neisseriagonorrhoeae、neophoca cinerea、odobenus rosmarus rosmarus、ovis aries、pusahispida、rattus norvegicus、sus scrofa、zalophus californianus中的任意一种或者几种。

82、根据本发明第一～三方面的任一实施方案的中性低聚糖的合成方法，所述的β-1,3-半乳糖基转移酶(ec 2.4.1.122)的来源包括但不限于caenorhabditis elegans、chromobacteriumviolaceum、drosophila melanogaster、escherichiacoli、gallusgallus、haemophilus influenza、homo sapiens、mus musculus、pseudogulbenkianiaferrooxidans、rattus norvegicus、sus scrof中的任意一种或者几种。