合成人参皂苷F1的糖基转移酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和植物生物学领域，具体地，涉及合成人参皂苷f1的糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术：

1、人参皂苷f1在人参中的含量极低(<0.3％)，却具有显著的抗衰老、益智和免疫调节等多种药理活性。传统的人参皂苷生产方法依赖于人参植物资源，不仅生产周期长达5-6年，且成本高昂(市场价格超过1000元/g)。人参皂苷rg1是三七中含量最为丰富的ppt型皂苷，其含量占到了三七总皂苷的20％-40％。合成生物学技术的应用为这一问题提供了新的解决方案，通过构建微生物细胞工厂可实现人参皂苷f1的高效合成。研究表明，人参皂苷f1可通过糖基转移酶pgugt71a53催化前体物质原人参三醇(ppt)转化而成。现有技术中已成功构建了高产ppt的工程菌株，其发酵罐产量可达8g/l以上，为人参皂苷f1的合成提供了充足的前体供应。然而，pgugt71a53在酿酒酵母表达系统中表现出双功能酶特性，不仅能够催化ppt生成f1，还能进一步将f1转化为rg1，这一特性严重制约了f1的生物合成效率。

2、因此，通过蛋白质工程技术对pgugt71a53进行定向改造，旨在获得特异性催化ppt生成f1且不产生副产物rg1的高效突变体。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种生产人参皂苷f1且不产生副产物rg1的糖基转移酶突变体。

2、本发明的第一方面，提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽的氨基酸序列在对应于seq id no：3所示氨基酸序列的第85位的氨基酸残基为非phe和/或在对应于seq idno：3所示氨基酸序列的第187位的氨基酸残基为非ser。

3、在另一优选例中，所述分离的多肽的氨基酸序列在对应于seq id no：3所示氨基酸序列的第85位的氨基酸残基为leu和/或在对应于seq id no：3所示氨基酸序列的第187位的氨基酸残基为ala。

4、在另一优选例中，所述分离的多肽选自下组：

5、(i)具有如seq id no：3所示氨基酸序列的第85位的氨基酸残基为leu和/或在对应于seq id no：3所示氨基酸序列的第187位的氨基酸残基为ala；

6、(ii)具有(i)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(i)所限定的分离的多肽功能的由(i)衍生的分离的多肽；

7、(iii)序列中含有(i)或(ii)中所述多肽序列的衍生多肽。

8、在另一优选例中，所述分离的多肽具有(i)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的序列，且基本具有(i)所限定的分离的多肽功能的由(i)衍生的分离的多肽。

9、在另一优选例中，所述分离的多肽为糖基转移酶。

10、在另一优选例中，所述糖基转移酶来源于人参属植物。

11、在另一优选例中，所述糖基转移酶来源于人参、西洋参和/或三七。

12、在另一优选例中，所述的多肽选自下组：

13、(1)具有如seq id no:4所示氨基酸序列的多肽；

14、(2)将seq id no:4所示氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；

15、(3)序列中含(1)或(2)中所述多肽序列的衍生多肽；

16、(4)氨基酸序列与seq id no:4所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)，并且具有糖基转移酶活性的衍生多肽。

17、在另一优选例中，所述的序列(3)为由(1)或(2)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

18、在另一优选例中，所述糖基转移酶能提高人参皂苷f1的产量。

19、在另一优选例中，在人工构建的菌株中，所述糖基转移酶能提高人参皂苷f1的产量；优选地，提高50-150％；更优选地，提高70-130％；更优选地，提高80-120％；最优选，提高90-110％。

20、在另一优选例中，所述人工构建的菌株选自下组：酿酒酵母菌株、大肠杆菌菌株、毕赤酵母菌株、裂殖酵母菌株、克鲁维酵母菌株。

21、本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸为选自下组的序列：

22、(a)编码如本发明第一方面所述多肽的核苷酸序列；

23、(b)编码如seq id no:4所示多肽或其衍生多肽的核苷酸序列；

24、(c)如seq id no:2所示的核苷酸序列；

25、(d)与seq id no:2所示序列的同源性≥90％(较佳地≥91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的核苷酸序列；

26、(e)在seq id no:2所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；

27、(f)与(a)-(e)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

28、本发明第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。

29、在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

30、本发明第四方面，提供了一种工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的多核苷酸。

31、在另一优选例中，所述的细胞为原核细胞或真核细胞。

32、在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。

33、在另一优选例中，所述的宿主细胞为酿酒酵母细胞。

34、在另一优选例中，所述的宿主细胞原核细胞，如大肠杆菌。

35、在另一优选例中，所述的宿主细胞为人参细胞。

36、在另一优选例中，所述宿主细胞不是天然生产人参皂苷f1的细胞。

37、本发明第五方面，提供了如本发明第一方面所述的多肽的用途，被用于催化以下反应，或倍用于制备催化以下反应的催化制剂：

38、

39、其中，所述式(i)化合物是原人参三醇(protopanaxatriol)，式(ii)化合物为人参皂苷f1(20-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol)。

40、在另一优选例中，所述的糖基供体包括选自下组的核苷二磷酸糖：udp-葡萄糖，adp-葡萄糖，tdp-葡萄糖，cdp-葡萄糖，gdp-葡萄糖，udp-乙酰基葡萄糖，adp-乙酰基葡萄糖，tdp-乙酰基葡萄糖，cdp-乙酰基葡萄糖，gdp-乙酰基葡萄糖，udp-木糖，adp-木糖，tdp-木糖，cdp-木糖，gdp-木糖，udp-木糖，udp-半乳糖醛酸，adp-半乳糖醛酸，tdp-半乳糖醛酸，cdp-半乳糖醛酸，gdp-半乳糖醛酸，udp-半乳糖，adp-半乳糖，tdp-半乳糖，cdp-半乳糖，gdp-半乳糖，udp-阿拉伯糖，adp-阿拉伯糖，tdp-阿拉伯糖，cdp-阿拉伯糖，gdp-阿拉伯糖，udp-鼠李糖，adp-鼠李糖，tdp-鼠李糖，cdp-鼠李糖，gdp-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。

41、在另一优选例中，所述的糖基供体包括选自下组的尿苷二磷酸(udp)糖：udp-葡萄糖，udp-木糖，udp-半乳糖醛酸，udp-半乳糖，udp-阿拉伯糖，udp-鼠李糖，或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其组合。

42、在另一优选例中，所述的糖基选自：葡萄糖基、半乳糖醛酸基、木糖糖基，半乳糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基，以及其他己糖基或戊糖基。

43、本发明第六方面，提供了如本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，用作发酵生产人参皂苷f1的菌株。

44、本发明第七方面，提供了一种生产人参皂苷f1的方法，包括步骤：

45、在适合培养的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含人参皂苷f1的发酵产物，从所述发酵产物中分离出人参皂苷f1。

46、在另一优选例中，所述培养包括试管培养、摇瓶培养、罐发酵培养。

47、在另一优选例中，所述试管培养使用ypd培养基。

48、在另一优选例中，所述摇瓶培养和/或罐发酵培养使用合成培养基。

49、在另一优选例中，培养所述工程化酵母菌的接种量为od600＝0.001～10，较佳地od600＝0.01～5，更佳地od600＝0.01～1，例如od600＝0.05。

50、在另一优选例中，所述工程化酵母菌在合成培养基中培养0.5～10天，较佳地1～8天，更佳地2～5天，例如，约4天。

51、在另一优选例中，所述ypd培养基包括1～20g/l酵母提取物、10～50g/l细菌源蛋白胨和10～50g/l d(+)-葡萄糖一水；较佳地，5～15g/l酵母提取物、15～40g/l细菌源蛋白胨和15～40g/l d(+)-葡萄糖一水；更佳地，8～12g/l酵母提取物、10～30g/l细菌源蛋白胨和10～30g/l d(+)-葡萄糖一水，例如，10g/l酵母提取物、20g/l细菌源蛋白胨和22g/l d(+)-葡萄糖一水。

52、在另一优选例中，在20～45℃下培养所述工程化酵母菌，较佳地25～40℃，更佳地25～35℃，例如，约30℃。

53、在另一优选例中，在培养为振荡培养，转速为100～500rpm，较佳地200～400rpm，更佳地200～300rpm，例如，约250rpm。

54、在另一优选例中，所述方法还包括步骤：检测所述发酵产物中的人参皂苷f1。

55、在另一优选例中，所述检测通过液相色谱分析。

56、在另一优选例中，所述方法的人参皂苷f1的产量≥120mg/l，较佳地150mg/ml，更佳地≥180mg/l，例如，约190mg/l、195mg/l或200mg/l。

57、在另一优选例中，所述方法的副产物人参皂苷rg1的含量≤5mg/l，较佳地≤3mg/l，更佳地≤1mg/l，最佳地≤0.5mg/l，例如，约0.4mg/l。

58、在另一优选例中，所述发酵产物中人参皂苷f1/rg1(w/w)≥300，较佳地≥350，更佳地≥400，最佳地≥450，例如，约470或480。

59、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。