基于片段组装的靶向PCSK9蛋白的纳米抗体及其获得方法和应用

本发明属于蛋白质工程，具体涉及靶向pcsk9蛋白受体催化结构域的纳米抗体及其获得方法与应用。

背景技术：

1、前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9 型（pcsk9）是一种由肝脏分泌的丝氨酸蛋白酶，在胆固醇代谢调控中发挥关键作用[4]。pcsk9 可与低密度脂蛋白受体（ldlr）结合并介导其溶酶体降解[5]，从而降低肝细胞表面 ldlr 的表达水平，导致血浆低密度脂蛋白胆固醇（ldl-c）水平升高[6]。因此，抑制 pcsk9 与 ldlr 的相互作用已成为治疗高胆固醇血症及动脉粥样硬化性心血管疾病的重要策略之一[7]。

2、目前，针对pcsk9的治疗手段主要包括单克隆抗体[8]（如alirocumab和evolocumab）以及小干扰 rna 药物[9]（如 inclisiran）。同时广泛使用于管理这类疾病的他汀类药物[10]，可以有效降低ldl-c水平，但其会引起不良副作用，部份患者无法耐受。与此同时，口服小分子 pcsk9 抑制剂（如mk-0616[11]）作为全球首个口服pcsk9抑制剂，有望成为心血管疾病防治领域的里程碑式突破。尽管上述药物在降低ldl-c水平方面具有显著疗效，但仍存在生产成本较高、给药方式受限以及组织穿透能力有限等问题。为解决这些问题，本发明采用基于片段组装的纳米抗体设计方法，筛选出优质的纳米抗体序列，为疾病的治疗提供新思路。

3、纳米抗体[12]（nanobody），又称单域抗体（vhh），来源于骆驼科动物的重链抗体[13]，仅由单个可变结构域构成。相较于传统抗体，纳米抗体具有分子量小、稳定性高、易于基因工程改造及表达成本低等优势[14, 15]，同时能够识别传统抗体难以结合的隐蔽表位，已广泛应用于疾病治疗[16]。与传统igg抗体相比，纳米抗体更适合进入复杂组织环境，亦可通过与人血清白蛋白（hsa）融合延长体内半衰期[17]，或设计成二价、三价或其他多价聚合模式[18]以增强抗原结合能力。此外，纳米抗体可通过吸入、黏膜递送等多种方式进行给药[19]，为复杂疾病的生物治疗提供新的策略。因此，纳米抗体在靶向pcsk9的治疗和诊断领域具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于片段组装的靶向pcsk9的纳米抗体及其获得方法和应用，以克服传统方法抗体筛选过程长、分子量大、靶向亲和力低的局限，所得到的纳米抗体可用于制备治疗高胆固醇血症及相关心血管疾病的药物。

2、本发明提供的靶向pcsk9的纳米抗体，记为p1s029、p1s116、p1s075、p1s039，其与靶蛋白的结合亲和性能力达到纳摩尔级别。

3、本发明还提出编码上述纳米抗体的核酸分子。

4、所述p1s029、p1s116、p1s075、p1s039的氨基酸序列和核苷酸序列分别如seq idno.1-4、seq id no.5-8所示。

5、本发明还提供一种表达载体，其含有上述多核苷酸序列。

6、本发明还提供一种宿主细胞，可以用于转化上述表达载体。

7、本发明提供的基于片段组装的靶向pcsk9的纳米抗体的获得方法，具体步骤为：

8、第一步：选择合适的目标表位与结合片段

9、为构建高效且易成药的纳米抗体，选取两种与pcsk9结合的高分辨率晶体结构复合物作为纳米抗体设计中结合片段提取的结构来源；第一种为pcsk9与低密度脂蛋白受体(ldlr)的egf-a域片段结合的复合物[1](pdb：4ne9)；第二种为pcsk9与人工设计蛋白adnectin结合的复合物[2](pdb：4ov6)；这两个复合物具备良好的结构分辨率，能够清晰揭示pcsk9在复合物状态下的结合界面残基的分布；

10、第二步：采用滑动窗口法进行结构片段化处理

11、即采用滑动窗口算法[3]对目标蛋白界面4 å范围内的结合残基及adnectin类cdr区序列进行结构片段化处理。具体而言，首先设定窗口长度为2–3个氨基酸、步长为1，以保证对界面连续子序列的全面覆盖；随后以结合界面残基为基础，按照滑动窗口方式逐位移动并提取所有可能的局部结构片段；最终将得到的候选片段作为输入，用于fragnano的后续纳米抗体设计与筛选。

12、第三步：基于片段的纳米抗体从头设计

13、fragnano是一种基于抗体结合片段组装的人工智能驱动从头设计方法，其流程可分为为三个步骤：首先，从sabdab[20]数据库中筛选目标抗原对应的抗原-抗体复合物结构，利用anarci对抗体序列进行编号并结合滑动窗口方法提取cdr区片段；其次，以已获批纳米抗体为来源，通过anarci与滑动窗口法提取框架区片段，用于构建基础结构骨架；最后，将滑窗得到的目标候选结合片段与片段库中的cdr和框架区片段进行匹配组装，生成候选纳米抗体序列，并结合alphafold3[21]进行结构预测与界面分析，从而获得优化后的纳米抗体序列（即若干条潜在结合pcsk9的纳米抗体序列）。

14、第四步：候选纳米抗体序列筛选

15、fragnano生成若干条潜在结合pcsk9的纳米抗体序列后，基于abnativ[22]提供的vhh-nativeness score与vh-humanness score构建联合评分体系，对潜在结合pcsk9的纳米抗体序列的人源化程度进行评估，筛选得到联合得分较高的若干序列，然后进一步以综合评分 ≥1.1313 且 vh-humanness ≥0.75 为标准，获得若干条候选序列；随后通过protein-sol[23]预测可溶性，筛选出 若干条高溶解性序列。进一步将高溶解性序列输入alphafold3进行结构建模，并基于iptm[24]指标评估复合物界面预测可靠性，结合位点分析，筛选出能够靶向pcsk9催化结构域的若干条序列。最后，利用antipasti[25]进行亲和力预测，并通过界面几何筛选，最终获得 若干条具有较高亲和力和良好结合能力的纳米抗体候选序列，用于后续实验验证。

16、第五步：实验验证

17、对纳米抗体候选序列，靶向pcsk9的纳米抗体基因经密码子优化后合成，并通过nrui和hindiii位点克隆至pd2p_1.08h载体，在c末端融合tev酶切位点、egfp及8×his标签。将重组质粒转化并扩增后，采用无细胞表达体系[26]进行孵育表达。表达产物使用his-tag磁珠进行纯化：依次经binding buffer结合、washing buffer洗涤、洗脱液洗脱后合并收集。纯化后的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）分离，蛋白质的表观分子量（mw）可以通过蛋白质的迁移距离来确定[27]。置于考马斯亮蓝染色液中染色，脱色后使用白光成像来判断蛋白成功纯化。

18、第六步：功能检测

19、使用微量热泳动技术[28] (microscale thermophoresis) 来检测所设计的纳米抗体对靶标pcsk9蛋白的结合亲和力。将pcsk9蛋白稀释16个浓度梯度，加入等量荧光标记的纳米抗体溶液进行混合孵育，随后上样至标准毛细管，使用mst仪器检测荧光信号变化。通过信号变化与配体浓度-反应曲线拟合，计算解离常数（kd）。结果显示，本发明所获得4条纳米抗体序列与pcsk9蛋白具有高亲和力结合，kd值达到纳摩尔级别，表明该纳米抗体能够高效靶向pcsk9抗原。

20、所述4条纳米抗体分别记为：p1s029、p1s116、p1s075、p1s039；其氨基酸序列分别如seq id no.1-4所示，编码上述纳米抗体的核苷酸序列分别如seq id no.5-8所示。

21、本发明还提供所述的靶向pcsk9的纳米抗体在制备治疗或预防pcsk9相关疾病的药物中的应用。所述疾病包括高胆固醇血症及相关心血管疾病等。