一种天然多酚铁基纳米酶及其制备方法与应用

本发明涉及农药残留检测，尤其涉及一种天然多酚铁基纳米酶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、丙环唑（pc）是一种广谱三唑类杀菌剂，广泛应用于农业领域。但其在环境中难以降解，易通过食物链富集，对人体健康和生态环境构成潜在威胁。因此，开发快速、灵敏、可靠的丙环唑残留检测方法至关重要。

2、现有丙环唑检测方法主要为高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等，这些方法灵敏度高，但存在仪器昂贵、操作复杂、检测周期长、不适合现场快速筛查等缺陷。近年来，基于纳米酶的比色法或荧光法因其操作简便而受到关注。然而，单一的检测模式易受样品基质颜色、共存物质、光散射等环境因素干扰，单一信号的变化难以区分是靶标物响应还是干扰因素所致，易导致假阳性结果，检测可靠性不足。

3、目前已公开了一些相关技术方案。例如，现有技术文献cn122187668a公开了一种ph-agnps纳米酶用于丙环唑的比色检测方法，但该方法仅依赖单信号输出，无法通过多通道相互验证，易产生假阳性，且纳米酶合成涉及长时间加热，不够绿色。现有技术cn116087185a公开了一种基于金纳米酶的双信号检测有机磷农药的方法，但该方法需依赖乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶，体系复杂、稳定性差、成本高，且两种信号呈同向变化，缺乏独立验证能力，不适用于丙环唑检测。现有技术文献cn117368187a公开了一种基于mof的比色荧光双模式传感器，但需使用特异性核酸适配体，成本高且稳定性差，合成工艺复杂，且检测靶标不适用于丙环唑。现有技术文献cn122130676a公开了一种自级联pt@fe-cds纳米酶检测有机磷农药的方法，但仍需依赖天然酶，体系复杂，两种信号同向变化，无法内置自验证。

4、综上所述，现有技术中仍缺乏一种简便、快速、低成本、高灵敏、高选择性且能实现内置自验证的双模式丙环唑检测方法及传感器。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提供一种天然多酚铁基纳米酶及其制备方法与应用，旨在解决现有丙环唑检测方法存在的仪器昂贵、操作复杂、单模式检测易假阳性或双模式信号同向变化无法自验证的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供一种天然多酚铁基纳米酶，所述纳米酶由迷迭香酸、香叶木素与铁盐溶液在室温水相中通过配位反应制得，所述纳米酶具有类过氧化物酶活性，可催化h2o2氧化tmb生成蓝色oxtmb，且该活性可被丙环唑分子中的三唑环特异性结合抑制。

3、此外，为了实现上述目的，本发明还提供一种上述所述天然多酚铁基纳米酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

4、步骤1，预先将香叶木素浓溶液与蒸馏水混合搅拌，得到香叶木素稀溶液，其中香叶木素浓溶液的浓度为40-60mmol/l，香叶木素浓溶液与蒸馏水的体积比为（2~3）:（100~150）；

5、步骤2，向步骤1的香叶木素稀溶液中依次加铁盐溶液、迷迭香酸水溶液，并在室温下搅拌反应4-6h，最后离心分离、冷冻干燥，得到天然多酚铁基纳米酶，其中，香叶木素稀溶液与铁盐溶液、迷迭香酸水溶液的体积比为(204~306):(4~6):(2~3)。

6、天然多酚铁基纳米酶的制备方法在室温、常压、水相条件下，通过简单搅拌即可完成配位反应，无需高温高压、有机溶剂或惰性气体保护，反应时间4-6小时，产物经离心、洗涤、冷冻干燥即得。

7、可选地，所述铁盐溶液为40~60mmol/l的fecl3水溶液，所述迷迭香酸水溶液的浓度为20~30mmol/l。

8、可选地，所述离心分离转速为10000rpm，分离时间为10min；所述冷冻干燥时间为5-10h。

9、此外，为了实现上述目的，本发明还提供一种比色-荧光双模式反向信号传感器，所述传感器包含上述所述的天然多酚铁基纳米酶、碳点cds、3,3',5,5'-四甲基联苯胺tmb、h2o2溶液和缓冲液。无丙环唑时，纳米酶催化tmb显色（652nm强吸收），同时oxtmb通过fret猝灭碳点荧光（630nm）；有丙环唑时，酶活被抑制，比色信号减弱，荧光信号恢复，形成反向变化。

10、此外，为了实现上述目的，本发明还提供一种上述所述传感器的丙环唑检测方法，所述方法包括以下步骤：

11、步骤1，将待测液与上述所述的天然多酚铁基纳米酶在常温下混匀并静置10-15min；

12、步骤2，向步骤1的产物中加入tmb、h2o2溶液和缓冲液，以进行显色反应；

13、步骤3，向步骤2的反应体系中加入碳点cds，测定反应体系在652nm处的吸光度和在激发波长529nm下630nm处的荧光强度；

14、步骤4，根据预先建立的线性回归方程，计算待测液中丙环唑的浓度。

15、可选地，步骤2中缓冲液为ph3.5-4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液。

16、可选地，步骤2中显色反应的温度为35-45℃，时间为30-40分钟。

17、可选地，步骤2中所述天然多酚铁基纳米酶的终浓度为10μg/ml，所述tmb的终浓度为1.5mm，所述h2o2的终浓度为8mm；步骤3中所述碳点的终浓度为10μg/ml。

18、此外，为了实现上述目的，本发明还提供上述所述天然多酚铁基纳米酶或传感器在制备农药残留检测试剂盒中的应用。将所述天然多酚铁基纳米酶或所述传感器封装为试剂盒形式，可实现对丙环唑残留的定性（肉眼比色）和定量（仪器读取）检测。

19、本发明检测原理为：无丙环唑存在时，所述天然多酚铁基纳米酶催化过氧化氢氧化tmb生成蓝色的oxtmb，在652nm处产生强比色信号；同时，oxtmb通过荧光共振能量转移猝灭碳点在630nm处的荧光。当丙环唑存在时，其分子中的三唑环与纳米酶的铁活性位点特异性结合，抑制纳米酶的类过氧化物酶活性，导致oxtmb生成减少，652nm处的比色信号减弱，同时碳点的荧光得以恢复，形成“比色信号降低、荧光信号升高”的反向信号响应，从而实现检测结果的内置自验证，有效降低假阳性。

20、有益效果：

21、（1）天然多酚铁基纳米酶的全部原料为天然植物来源的多酚化合物，无毒无害，生物相容性优异，避免了传统纳米酶合成中有毒配体或重金属的使用。以及酶活性可被丙环唑通过三唑环与铁活性位点的特异性结合精确抑制，为构建高选择性响应型传感器提供了理想的识别元件。同时，室温水相合成的非晶态结构赋予其优异的储存稳定性和重复使用性，优于天然辣根过氧化物酶。

22、（2）天然多酚铁基纳米酶的制备方法在室温、常压、水相下一锅法合成，无需高温高压、有机溶剂或惰性气体保护，操作简便，易于工业化放大。并且全程室温搅拌，能耗极低，无有机溶剂排放，符合绿色化学理念。以及原料廉价易得，合成过程无需昂贵设备或耗材，显著降低纳米酶的制备成本。

23、（3）比色-荧光双模式反向信号传感器，实现双模式自验证：比色信号与荧光信号呈反向变化，可相互校验，从根本上降低假阳性率，检测可靠性显著优于单模式或同向双模式传感器。并且摆脱天然酶依赖，即完全替代辣根过氧化物酶，克服了天然酶成本高、易失活、储存条件苛刻的固有缺陷。同时，抗干扰能力强，双通道输出可有效区分靶标响应与非特异性干扰，适用于复杂基质样品的检测。

24、（4）基于传感器的丙环唑检测方法，具有高灵敏度与宽线性，其检测下限达亚微摩尔级别，线性范围覆盖实际农残浓度需求，满足定量检测要求。以及从样品处理到结果输出仅需约1小时，无需大型精密仪器，适合现场快速筛查。同时，双模式交叉验证机制确保即使某一通道受干扰，另一通道仍可提供有效数据，避免误判。

25、（5）试剂盒可常温运输和储存，无需冷链，适用于田间地头、批发市场等现场即时检测场景。通过替换纳米酶或调整识别单元，可拓展至其他三唑类农药乃至多种农药残留的同时检测。为食品安全监管和环境监测提供低成本、高效率的检测工具，助力精准农业和风险预警体系建设。