用于半胱氨酸的高水溶性和稳定性化学传感器的制作方法

本发明涉及用于测试样品、优选水性测试样品中的半胱氨酸的改进的检测的化学探针，以及相应的用途和试剂盒。

背景技术：

1、半胱氨酸 (cys) 在生物合成、解毒和代谢中是重要的。总半胱氨酸水平升高可以预测心血管疾病和代谢综合征。已知半胱氨酸缺乏是衰老的后果之一。在结构相似的同型半胱氨酸 (hcy) 或谷胱甘肽 (gsh) 上选择性检测 cys 仍然是一个巨大的挑战。尽管检测 cys 的方法有很多，但光致发光 (pl) 和电化学发光 (ecl) 技术因其高灵敏度而非常适合临床诊断和分析技术。

2、重组单克隆抗体中的三硫化物的形成是异质性的来源，其需要被控制以保证产品质量的一致性。ryll

等人(kshirsagar, r.; mcelearney, k.; gilbert, a.; sinacore,m.; ryll, t. biotechnol. bioeng. 2012, 109, 2523) 已经表明进料培养基中的 l-半胱氨酸 (cys) 浓度与产品 (igg1 mab) 中的三硫化物水平直接相关。因此，需要控制 cys进料策略以将三硫化物的形成降低到可接受的水平。

3、迄今为止，cys 的检测在各种生化应用中引起了广泛的关注。已经开发出许多用于检测 cys 的方法，诸如与 ellman 的试剂结合或与荧光组合的荧光测定法、电位测定法、电化学伏安法和 hplc。这些方法需要复杂的仪器、涉及繁琐的实验室程序或者通量低。

4、kim 和 hong（在：photoluminescence and electrochemiluminescence dual-signaling sensors for selective detection of cysteine based on iridium(iii)complexes.acs omega 2019, 4, 7, 12616–12625）报告了使用环金属化铱(iii) 络合物用于区分 cys 与 hcy 和 gsh 的 pl 和 ecl 双通道传感器。

5、uv-vis 光谱法提供快速、简单的测量程序。因此，为了量化生物过程中的必需代谢物，需要使用自动分析仪，诸如 cedex bio ht (roche diagnostics, penzberg,germany) 进行光度测定。但只有少数候选物可以用于 cedex bio ht 分析仪 (“cedex”)上的比色 cys 检测，并且该分析装置仅提供一组有限的波长：340、378、409、480、512、520、552、583、629、652、659 和 800 nm。此外，cedex 系统的理想探针必须包括高灵敏度、快速响应、水溶性和稳定性以及易用性。

6、迄今为止，大多数 cys 的指标都是基于硫醇基团的强亲核性。已经采用各种机制，包括迈克尔加成和裂解反应。基于丙烯酸酯基团的传感策略似乎很有前景，因为它允许将 cys 与其他氨基酸和硫醇区分开来 (han, q.; shi, z.; tang, x.; yang, l.; mou,z.; li, j.; shi, j.; chen, c.; liu, w.; yang, h.; liu, w. organic&biomolecular chemistry 2014, 12, 5023)。图 1 在给出了传感机制。该策略涉及 cys与丙烯酸酯的共轭加成以生成硫代酸酯，然后进行分子内环化。作为硫醇活化位点的丙烯酸酯部分仅与 cys 发生快速环化，因为反应速率很大程度上取决于所得内酰胺的环大小。移除掩蔽丙烯酸酯基团之后，发色团的共轭 π-电子系统恢复，从而实现比色响应。

7、不利地，只有少数基于丙烯酸酯的探针在 cedex 上使用所需的波长处具有强烈的比色响应。它们的发色团基于氧杂蒽、部花青、七甲川和荧光素。大多数报道的丙烯酸酯应用于有机溶剂-水混合物中，这一事实显然是由于它们在水性介质中的溶解度差而必需的。然而，对于 cedex 上的应用来说探针必须溶于水，因为仪器的部分对有机溶剂不稳定。此外，还必须评估现有探针的稳定性，以确保测定溶液可以在 cedex 中保存持续合理的时间。

技术实现思路

1、鉴于这些和其他缺点，本发明的一个目的是提供可以用于水性溶液中并且在所需波长中的一个处提供足够的比色响应的 cys 探针。当研究本发明的当前描述时，其他目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。

2、在本发明的第一方面，上述目的通过根据式 (i) 的一种化合物来解决，

3、

4、其中

5、r1和 r2独立地选自 r3、o-r3、s-r3、so3-、so3-r3，其中 r3选自 c1-c18烷基，和聚乙二醇 (peg) 残基，

6、acc 选自这样的组，该组选自式 ii

7、，

8、其中 x 选自 —n(ch3)-、—s—、—se—、—o— 和 —c(ch3)2-，

9、式 iii

10、

11、式 iv

12、，和

13、iv

14、式 v

15、，

16、v

17、其中任选地在式 ii 至 v 中的每一者中，芳香环经 1、2 或 3 个 so3-基团取代，

18、r4选自 c1-c18烷基、c1-c6环烷基和 (ch2)m-so3-的组，其中 m 为选自 1 至 18 的整数，并且 n 选自 1、2 和 3，以及其合适的盐和溶剂化物。

19、本发明人合成了一系列基于部花青发色团的丙烯酰酯（图 2，见下文）；制备了探针lz07作为对照并且用于比较，并且该探针从文献 (han, q.; shi, z.; tang, x.;yang, l.; mou, z.; li, j.; shi, j.; chen, c.; liu, w.; yang, h.; liu, w.organic&biomolecular chemistry 2014, 12, 5023) 中是已知的。然后，本发明人研究了丙烯酰酯的光谱性质、水溶性和稳定性，并且评估了对 cys 的响应。可以证明化学设计提供了专用探针，特别是针对 cedex。

20、优选的为根据本发明的式 i 化合物，其中 r1和 r2独立地选自 r3、o-r3、s-r3、so3-、so3-r3，其中 r3选自 c1-c6烷基，和聚乙二醇 (peg) 残基，

21、acc 为式 ii

22、，

23、ii

24、其中 x 选自 —n(ch3)-、—s—、—se—、—o—和 —c(ch3)2-，任选地芳香环经1、2 或 3 个 so3-基团取代，r4选自 c1-c6烷基、c1-c6环烷基和 (ch2)m-so3-，其中 m 为 1至 6 的整数，并且 n 为 1，以及其合适的盐和溶剂化物。

25、进一步优选的为根据本发明的式 i 化合物，其中 r1和 r2独立地选自 r3、o-r3、s-r3、so3-、so3-r3，其中 r3选自 c1-c3烷基，和聚乙二醇 (peg) 残基，

26、acc 为式 ii

27、，

28、ii

29、其中 x 为 —c(ch3)2-，任选地 芳香环经 1、2 或 3 个 so3-基团取代，r4为(ch2)m-so3-，其中 m 为 1 至 6 的整数，并且 n 为 1，以及其合适的盐和溶剂化物。

30、进一步优选的为根据下式 vi 至 ix 的根据本发明的式 i 化合物

31、vi，

32、vii，

33、viii，

34、，以及其合适的盐和溶剂化物。

35、在本发明的上下文中，合适的盐通常是不干扰或基本上不干扰根据本发明的化合物的溶解度，特别是在水性介质中的溶解度的盐。实例是含有第 i 族元素（li+、na+、k+、cs+、rb+）、铵离子 (nh4+)、硝酸根离子 (no3-)、含有 cl-、br-或 i-的盐，或硫酸盐。

36、本发明的又一个方面涉及一种用于制备根据本发明的式 i 化合物的方法，该方法包括以下步骤：

37、a) 使式 vi 化合物

38、

39、其中 r1和 r2如上文所定义，并且 n 为 1 或 2，与式 ii 化合物

40、

41、或与式 iii 化合物

42、

43、或与式 iv 化合物

44、

45、或与式 v 化合物

46、

47、其中在式 ii 至 v 中的每一者中，任选地，芳香环经 1、2 或 3 个 so3-基团取代，r4选自 c1-c18烷基、c1-c6环烷基和 (ch2)m-so3-，并且其中 m 为 1 至 18 的整数，适当地反应以得到式 viii 化合物

48、

49、其中 r1、r2和 acc 如上文所定义，并且 n 是 1 或 2，以及 b) 使式 viii 化合物与丙烯酰氯适当地反应。执行上述方法的合适的条件是本领域的技术人员已知的，并且示例性地公开在下文的实例和方案中。

50、本发明的又一方面涉及一种用于在测试样品中检测半胱氨酸的方法，该方法包括以下步骤：a) 在与预期含有半胱氨酸的测试样品接触之前和之后在合适的溶剂中测量根据本发明所定义的化合物的溶液的 uv/vis 吸光度，以及 b) 通过比较在步骤 a) 中所测量的 uv/vis 光谱来确定吸光度的差异，以及 c) 基于在步骤 b) 中所确定的所述吸光度的差异而在所述测试样品中检测半胱氨酸。

51、根据本发明的测试样品可以包括任何包含或预期包含半胱氨酸的样品。实例为，例如，检测血浆、从患者得到的样品、不同细胞系中的总蛋白、组织样品、细胞裂解物、血清、唾液或尿液、抗体样本以及在生物技术应用中使用的样本中的生物硫醇。优选的为在cedex 系统中待分析的水性生物样品。

52、在 cys 的存在下记录的光谱通过丙烯酰酯的裂解证实了比色响应。合成的探针示出了向可见光谱（表 2）的绿色和黄色范围的显著的红移。优选的为根据本发明的方法，其中在 200 nm 至 1000 nm 范围内的离散波长处测量 uv/vis 吸光度。此外，它们的光谱分布有利地满足了 cedex 系统中 cys 传感应用的波长要求（340、378、409、480、512、520、552、583、629、652、659 和 800 nm）。

53、更优选的为根据本发明的方法，其中溶剂为水性溶剂。

54、在本发明的优选的方面，根据本发明的方法，其中所述确定吸光度的差异是通过颜色变化的目视检查进行的，诸如向可见光谱的绿色和黄色范围的显著的红移。作为实例，以稍微不同的方法，hai-feng yin 等人（在：simple probe with visible color changefor selective detection of cysteine, spectroscopy letters, (2020) doi:10.1080/00387010.2020.1821063）合成了荧光探针，其可以选择性地检测半胱氨酸。添加半胱氨酸之后，通过肉眼观察探针溶液示出了从浅黄色到橙色的明显颜色变化。

55、根据本发明的方法，其中所述确定吸光度的差异是通过 cedex bio ht (rochediagnostics, penzberg, germany) 进行的。

56、本发明的又一方面涉及一种用于在测试样品中检测半胱氨酸的试剂盒，该试剂盒包括小瓶或容器以及用于使用所述试剂盒的手册，该小瓶或容器包括预定量的根据本发明的化合物。所包括的材料的实例为，例如，标准品、根据本发明的探针和缓冲液。

57、本发明的又一方面涉及根据本发明的化合物、或根据本发明的试剂盒用于在测试样品、优选为如本文公开的水性测试样品中检测半胱氨酸的用途。