用于鉴定和回收目的基因簇的高通量方法与流程

本发明涉及用于鉴定/定位目的基因簇的方法。特别地，本发明涉及在原核和真核细胞中发现新的生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster，bgc）。因此，本发明适用于筛选克隆文库。相应地，本发明涉及能够与高通量研究兼容的方法，并且这些方法能够与以经济且高效的方式检测多个基因簇兼容。

背景技术：

1、普遍需要从宿主生物体中鉴定新的产物，特别是次级代谢物。

2、这样的代谢物可包括在临床上具有价值的分子，例如抗菌和抗真菌产物，特别是在抗微生物耐药性背景下，如lewis（“the science of antibiotic discovery”; cell181, 2020）中所报道的。

3、然而，对这样的代谢物的表征和分离也具有挑战性。

4、这样的代谢物通常由多于一个基因的产物酶促生物合成，所述基因通常聚集成基因簇。

5、此外，这样的基因簇在实验室条件下可能不易表达。或者，当克隆到属于不同物种或甚至不同属的微生物中时，这样的基因簇可能差异表达。

6、当在不同条件中培养相应的宿主时，这样的基因簇也可能差异表达。

7、另外，这样的基因簇包括多个基因，因此导致高分子量核酸，所述高分子量核酸可能难以克隆，或合成成本昂贵，或以无偏的方式进行测序的成本昂贵。

8、因此，需要能够以高效且成本友好的方式鉴定、克隆和回收这样的基因簇，尤其是在微生物中鉴定、克隆和回收这样的基因簇的新方法。

9、一种策略在于将可能包含基因簇的整个基因组以随机基因组片段文库的形式进行克隆，并然后筛选克隆以定位和回收目的片段。

10、筛选克隆文库以找到少数目的克隆的定位仍然是耗时且耗资源的步骤。这通常例如通过使用pcr策略和针对这样的簇的保守区域的引物来完成。然后可对扩增子进行测序以提供对扩增物质性质的额外见解，这可用于去重复。

11、在另一方面中，对每个单独的克隆进行pcr将是不切实际的。因此，已建议减少在给定克隆文库中定位克隆所需的pcr步骤数目。

12、owen等（“mapping gene clusters within arrayed metagenomic libraries toexpand the structural diversity of biomedically relevant natural products”;pnas, vol. 110, no. 29, 2013）教导了来自黏粒克隆文库的条码化pcr扩增子的多重测序。

13、lam等（“evaluation of a pooled strategy for high-throughput sequencingof cosmid clones from metagenomic libraries”; 2014 plos one 9(6): e98968.doi:10.1371/journal.pone.0098968）教导了混合测序策略，其涉及将克隆组合到一个样本中进行测序和组装，并然后使用先前获得的sanger末端标签来回收特定克隆序列。

14、libis等（“uncovering the biosynthetic potential of rare metagenomicdna using co-occurrence network analysis of targeted sequences”; nat commun.,10(1):3848, 2019）和wo2021041397a2教导了使用靶向保守区域的简并pcr引物来扩增克隆池，并结合一种预测算法，该预测算法需要鉴定显示出非随机出现的结构域对。

15、libis等（“multiplexed mobilization and expression of biosynthetic geneclusters”; 13:5256, 2022）教导了前述方法的变体，其同样依赖于简并引物扩增，但还包括将大且完整的基因簇直接克隆到最终穿梭载体中的步骤。

16、crits-christoph等（“novel soil bacteria possess diverse genes forsecondary metabolite biosynthesis”; nature, 558, 440-444, 2018）阐明了一个案例，其中使用基因组解析的宏基因组方法从头重构了来自土壤生态系统的微生物的近完整基因组。还评估了简并引物用于检测目的基因簇的性能；从而得出这样的结论：这样的引物可能无法扩增遗传上趋异的序列。

17、因此，尽管这样的方法在鉴定编码临床上具有价值的代谢物的基因簇方面仍然有效，但它们仍然高度依赖于引物的选择，并且因此往往局限于预先确定的簇；特别是某些生物合成基因簇（bgc）类别，以及引物可在其上结合的其他保守序列。

18、此外，旨在从池中物理回收对应于bgc的克隆的pcr筛选是耗时的，并且通常产生含有引物结合位点但并非全部目的序列的截短bgc。

19、因此，仍然需要以无偏、高效且完整的方式在细胞及其他微生物中鉴定、回收和分离目的基因簇的新的方法。

20、仍然需要弥补基于扩增子的测序中对简并引物的需求而引起的偏倚。

21、本发明的目的旨在满足上述需求。

技术实现思路

1、因此，本发明涉及用于鉴定至少一个目的基因簇的方法，所述方法包括以下步骤：

2、a）提供克隆文库，所述克隆文库包含多个具有高分子量核酸的克隆，所述核酸可能编码或包含目的基因簇；

3、b）将所述克隆文库划分成至少第一多个独立分区和第二多个独立分区：

4、- 所述第一多个独立分区包含多个克隆，所述多个独立分区从而形成多个克隆池；

5、- 所述第二多个独立分区包含来自克隆池的多个克隆，从而形成多个克隆堆；

6、其中，对来自所述克隆池和所述克隆堆的高分子量核酸进行片段化；

7、c）测定所述克隆池和所述克隆堆中经片段化的高分子量核酸的全部或部分的核酸序列，从而提供多个序列读段，对应于所述多个序列读段的测序深度小于30×，例如小于20×；从而鉴定所述至少一个目的基因簇。

8、因此，该方法适用于鉴定克隆文库中以及先前从其获得所述克隆文库的细胞中的目的基因簇。

9、因此，该方法适用于定位克隆文库中以及先前从其获得所述克隆文库的细胞中的目的基因簇。

10、因此，该方法适用于回收克隆文库中以及先前从其获得所述克隆文库的细胞中的目的基因簇。

1.用于鉴定至少一个目的基因簇的方法，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其用于鉴定真核细胞或其克隆文库中的多个基因簇；所述真核细胞特别地是真菌，优选地为丝状真菌，例如属于曲霉（aspergillus）属的真菌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其用于鉴定真菌或其克隆文库中的多个生物合成基因簇（bgc）。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多个生物合成基因簇（bgc）用于合成非核糖体肽（nrps）、聚酮化合物（pks）、萜烯、氨基糖苷类、细菌素、套索肽、羊毛硫肽、核苷、膦酸盐/酯、或其组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中至少一个目的基因簇是用于合成nrps或pks的bgc。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一个目的基因簇的大小为至少20 kbp，例如范围为20 kbp至200 kbp。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，所述克隆文库的特征在于所述高分子量核酸的大小为至少20 kbp，例如范围为20 kbp至200 kbp。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述克隆文库的特征在于其由选自下的克隆载体文库组成：黏粒、福斯质粒、噬菌体、细菌人工染色体（bac）、p1来源的人工染色体（pac）、酵母人工染色体（yac）、真菌人工染色体（fac）。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述克隆文库包含穿梭载体或由穿梭载体组成，所述穿梭载体适用于在属于不同属或界的多种细胞中复制，更特别地一种属于链霉菌（streptomyces）属并且另一种属于埃希菌（escherichia）属；优选地所述穿梭载体适用于在大肠杆菌（e. coli）中复制并转移到链霉菌属物种（streptomyces spp.）中。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其包括多个划分所述克隆文库的步骤；从而形成多于两个分区。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法；测定所述克隆池和所述克隆堆中的高分子量核酸的序列的步骤包括：

13.根据权利要求12所述的方法，其中对应于所述多个序列读段的测序深度小于20×；例如小于1×。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中来自所述多个克隆池的每个克隆池在统计学上包含所述至少一个目的基因簇的小于两次出现，特别地最多一次出现；和/或来自所述多个克隆堆的每个克隆堆在统计学上包含所述至少一个目的基因簇的小于两次出现，特别地最多一次出现。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其包括从所述文库中回收，优选地分离包含所述至少一个目的基因簇的克隆的步骤。