一种高通量纯培养与16SrRNA扩增子测序相结合的细菌分析方法

本发明属于微生物分析，具体涉及一种高通量纯培养与16s rrna扩增子测序相结合的细菌分析方法。

背景技术：

1、微生物高通量纯培养结合16s rrna测序技术比对手段，是现阶段环境微生物资源解析、菌株溯源追踪、微生物群落结构分析的核心技术体系。通过将高通量分离获得的纯培养菌株16s rrna基因全长序列与微生物样本的扩增子序列进行比对匹配，可精准明确环境中可培养功能菌株的分布规律与定植特征，为功能菌株开发利用、生态环境修复、微生物菌种资源保藏等工作提供关键的数据支撑与理论依据。

2、但是目前16s rrna扩增子测序和纯培养细菌菌株鉴定两种技术体系长期相互割裂，尚未形成有效的交叉验证机制与整合分析手段，存在明显的技术断层。一方面，16srrna扩增子测序技术存在固有缺陷。该技术受扩增引物特异性限制，部分微生物的基因序列无法与常规引物有效匹配，导致此类微生物在群落结构分析中被遗漏，无法被检测识别；同时，扩增所得基因片段长度较短，物种种系区分精度不足，难以实现菌株水平的精细化分类鉴定，无法满足高精度微生物研究需求。另一方面，微生物纯培养菌株的16s rrna序列鉴定技术存在明显短板。当前主流鉴定方式为单菌落pcr扩增后，与ncbi等公共数据库开展局部序列比对，该技术通量低、检测效率低，且无法与环境样本扩增子测序数据建立系统性、标准化的对应关联关系。两种主流技术各自独立应用、缺乏联动，致使大量扩增子测序挖掘得到的微生物类群信息，无法与实验室可培养菌株建立精准对应关系，不仅造成海量测序数据资源的闲置与浪费，还极大限制了功能微生物的精准挖掘、筛选及产业化开发利用，制约了环境微生物资源的高效转化与应用。

3、因此，行业内亟需一种可实现纯培养菌株序列与16s rrna扩增子数据系统化、精准化匹配分析的技术方案，打通环境微生物“高通量检测识别”与“实体菌株获取利用”之间的技术壁垒。

4、现有传统的序列匹配分析技术体系存在多项固有技术缺陷，从测序基础、比对算法、数据库适配、判定机制到结果输出均存在短板，大幅降低了序列匹配精度与分析结果的可靠性、全面性，具体缺陷如下：

5、第一，短片段测序菌株分辨率不足。传统方法多采用v3-v4可变区短扩增子测序，序列信息有限，难以区分近缘菌种及同种微生物不同菌株；且短扩增子区间与27f/1492r扩增的全长16s rrna区间不一致，易产生序列比对偏差，鉴定准确率偏低。第二，传统blast比对模式存在固有缺陷。通用全局blast比对未区分16s rrna保守区与高变区，统一的比对规则易造成虚假匹配，难以识别菌株间细微序列差异，菌株水平鉴定精度不足。第三，公共数据库适配效果不佳。现有分析多直接依托ncbi通用数据库，缺少自建纯培养菌株全长序列参考库；公共数据库序列来源复杂、标准不统一，降低序列匹配特异性。第四，序列判定方式僵化，缺少污染质控手段。传统方案依靠固定97%相似度阈值进行判定，无法量化匹配置信度，质控体系缺失。第五，分析结果输出形式单一。仅提供简单定性匹配结论，缺少结果分级与权重评价体系，难以支撑精细化微生物研究及产业化应用。

6、综上所述，现有技术在测序体系设计、比对算法逻辑、数据质控校正、结果判定体系等多个核心维度均存在明显技术短板，无法实现纯培养菌株序列与扩增子数据的精准匹配分析。基于此，行业内亟需一种依托扩增子数据标准序列、搭载改进型精准比对算法、可实现结果量化分级的低成本、高效率创新型序列匹配分析方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高通量纯培养与16s rrna扩增子测序相结合的细菌分析方法，本发明所述方法通过算法改良解决传统blast全局比对易出现局部错配、高变区特征丢失、同源序列误匹配的问题，大幅提升全长16s rrna菌株匹配精度与菌株水平分辨率，普适性强、落地性高。

2、本发明提供了一种高通量纯培养与16s rrna扩增子测序相结合的细菌分析方法，包括如下步骤：

3、（1）对待测样本进行随机分组，得到第一组待测样本和第二组待测样本；

4、（2）对第一组待测样本中的细菌进行高通量纯培养，获得若干可培养纯菌株，对所述若干可培养纯菌株的全长16s rrna进行扩增，获得若干16s rrna全长序列；

5、（3）对第二组待测样本中的细菌进行扩增子测序，测序结果按97%序列相似度聚类，获得扩增子细菌操作分类单元（operational taxonomic unit，otu），基于所述扩增子细菌操作分类单元建立标准扩增子库；

6、（4）将所述若干16s rrna全长序列与所述细菌操作分类单元进行分区比对筛选，获得高可信度全长序列；

7、所述分区比对筛选的方式包括：对核心高变区进行比对初筛，设置高变区e-value≤1×10-5；再利用保守区进行全局验证，设置全长整合e-value≤1×10-10，过滤局部同源、整体失真的虚假匹配结果；

8、所述核心高变区包括v1-v2、v3-v4和v5-v6区；所述保守区为c3区；

9、（5）将所述高可信度全长序列与所述细菌操作分类单元进行分区比对，得到高变区平均相似度和保守区相似度，按照式i计算综合相似度；

10、综合相似度=高变区平均相似度×0.8＋保守区相似度×0.2           式i；

11、所述高变区平均相似度为v1-v2、v3-v4和v5-v6区相似度的平均值；

12、当所述综合相似度≥99%时，所述16s rrna全长序列对应的细菌与细菌操作分类单元对应的菌株同种；

13、当97.0%≤所述综合相似度<99.0%时，所述16s rrna全长序列对应的细菌与细菌操作分类单元对应的菌株同属；

14、当93.0%≤所述综合相似度<97.0%时，所述16s rrna全长序列对应的细菌与细菌操作分类单元对应的菌株为近缘菌属；

15、当所述综合相似度<93%时，所述16s rrna全长序列对应的细菌为未知菌株或外源杂菌。

16、作为一种优选方案，步骤（2）所述高通量纯培养的方法包括梯度稀释法。

17、作为一种优选方案，步骤（2）所述待测样本包括土壤样本，所述土壤样本的高通量纯培养方法包括以下步骤：

18、将土壤样本制备成土壤菌悬液，对所述土壤菌悬液进行梯度稀释，选取最佳稀释度菌悬液作为接种原液；所述最佳稀释度菌悬液的标准为：接种培养后阳性孔以单一菌株生长为主；

19、将所述接种原液与lb液体培养基混合后进行培养，经筛选、纯化后获得土壤可培养纯菌株。

20、作为一种优选方案，步骤（2）所述扩增的引物包括27f和1492r；所述27f的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述1492r的核苷酸序列如seq id no:2所示。

21、作为一种优选方案，步骤（2）还包括基于所述获得16s rrna全长序列建立全长待测子库。

22、作为一种优选方案，步骤（2）所述建立全长待测子库前，还包括对全长16s rrna扩增序列进行质控筛选的过程；

23、所述质控筛选的过程包括：去除嵌合体、低质量碱基占比>5%、片段残缺及结构异常序列；修剪两端冗余碱基，保留完整v1-v9全长序列，剔除基因型完全一致的重复菌株，获得16s rrna全长序列。

24、作为一种优选方案，步骤（2）所述16s rrna全长序列包括v1-v9区。

25、作为一种优选方案，步骤（3）所述扩增子测序使用的引物包括27f和1492r；所述27f的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述1492r的核苷酸序列如seq id no:2所示。

26、作为一种优选方案，步骤（3）进行所述相似度聚类前，还包括降噪和去除外源污染的过程。

27、作为一种优选方案，步骤（3）所述建立标准扩增子库前，还包括对所述扩增子细菌操作分类单元进行物种注释的过程。

28、有益效果：本发明提供了一种高通量纯培养与16s rrna扩增子测序相结合的细菌分析方法，包括如下步骤：（1）对待测样本进行随机分组，得到第一组待测样本和第二组待测样本；（2）对第一组待测样本中的细菌进行高通量纯培养，获得若干可培养纯菌株，对所述若干可培养纯菌株的全长16s rrna进行扩增，获得若干16s rrna全长序列；（3）对第二组待测样本中的细菌进行扩增子测序，测序结果按97%序列相似度聚类，获得扩增子细菌操作分类单元，基于所述扩增子细菌操作分类单元建立标准扩增子库；（4）将所述若干16s rrna全长序列与所述细菌操作分类单元进行分区比对筛选，获得高可信度全长序列；所述分区比对筛选的方式包括：对核心高变区进行比对初筛，设置高变区e-value≤1×10-5；再利用保守区进行全局验证，设置全长整合e-value≤1×10-10，过滤局部同源、整体失真的虚假匹配结果；所述核心高变区包括v1-v2、v3-v4和v5-v6区；所述保守区为c3区；（5）将所述高可信度全长序列与所述细菌操作分类单元进行分区比对，得到高变区平均相似度和保守区相似度，按照式i计算综合相似度；所述高变区平均相似度为v1-v2、v3-v4和v5-v6区相似度的平均值；当所述综合相似度≥99%时，所述16s rrna全长序列对应的细菌与细菌操作分类单元对应的菌株同种；当97.0%≤所述综合相似度<99.0%时，所述16s rrna全长序列对应的细菌与细菌操作分类单元对应的菌株同属；当93.0%≤所述综合相似度<97.0%时，所述16srrna全长序列对应的细菌与细菌操作分类单元对应的菌株为近缘菌属；当所述综合相似度<93%时，所述16s rrna全长序列对应的细菌为未知菌株或外源杂菌。本发明采用全长16srrna基因体系构建纯培养细菌菌株全长待测子库和16s rrna标准扩增子库，创新性提出一种分段优先、容错过滤、分区校验的改进型比对方法，结合全长序列分区加权打分模型、四级匹配置信度分级判定体系，实现环境扩增子序列与纯培养菌株全长序列的高精度、抗干扰、可量化匹配分析。本发明在不增加实验成本的前提下，通过算法改良解决传统blast全局比对易出现局部错配、高变区特征丢失、同源序列误匹配的问题，大幅提升全长16srrna的菌株匹配精度与菌株水平分辨率，普适性强、落地性高，适用于各类环境微生物菌株溯源、资源挖掘与菌种鉴定场景。

29、与现有技术相比本发明还具有以下有益效果：

30、1、引物与序列体系创新：采用27f/1492r全长标准序列，覆盖全部v1-v9区，彻底解决短片段信息残缺、比对错位问题，菌株分辨率显著提升。

31、2、比对算法核心创新：突破传统标准blast全局均质比对模式，首创高变区优先、分区比对、分层容错、局部假匹配过滤的改进型blast机制，解决保守区掩盖特异性差异、近缘菌株错配的核心技术难题，具备极强创造性。

32、3、质控体系创新：增设双重阴性对照背景扣除，从源头消除实验污染导致的假阳性，匹配结果更可靠。

33、4、判定体系创新：采用全长分区加权打分+四级量化分级，摒弃固定阈值一刀切，实现匹配结果精细化、可量化、可溯源。

34、5、成本优势突出：全部创新均为生物信息流程与算法改良，无需新增实验设备、耗材与检测步骤，零额外成本，普适性极强。