一种益生菌发酵来源的低分子量黄精果聚糖、其制备方法及用途与流程

本申请涉及微生物发酵，具体涉及一种利用益生菌发酵制备的低分子量黄精果聚糖及其在调节肠道菌群、改善肠道微生态平衡中的应用。

背景技术：

1、黄精（polygonatum sibiricum）为我国传统药食同源植物资源，富含多糖、皂苷、黄酮等多种活性成分。其中，黄精多糖作为主要活性物质之一，近年来被广泛研究。已有研究表明，黄精多糖具有抗氧化、免疫调节、代谢调控以及改善肠道微生态等多种生物活性。随着“肠道菌群—宿主健康”研究的发展，天然来源多糖作为重要的膳食碳源，可通过被肠道微生物选择性利用，影响菌群组成及代谢产物生成。因此，利用植物来源多糖调节肠道微生态已成为功能食品、生物医药及营养干预领域的重要研究方向。

2、目前，黄精多糖的制备方法主要包括水提醇沉、超声辅助提取、酶辅助提取等。传统提取方法所得多糖通常具有较高分子量和复杂结构等特征，导致其溶解性、扩散性以及肠道菌群利用效率受到一定限制。

3、近年来，微生物发酵技术因其反应条件温和、选择性高且环境友好等优势，已被尝试用于植物多糖的结构修饰和功能强化。然而，现有技术对于如何利用具有特定多糖利用能力的益生菌对黄精原料进行定向发酵，并获得具有特定分子量范围和明确结构特征的低分子量黄精多糖，并系统评价其对肠道菌群的具体调节作用，目前尚缺乏相关技术方案。

4、因此，开发一种利用益生菌发酵制备具有特定结构特征和肠道菌群调节功能的低分子量黄精多糖，对于提高黄精资源利用价值及开发新型功能食品具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本申请的目的在于提供一种益生菌发酵来源的低分子量黄精果聚糖、其制备方法及用途。本申请通过筛选获得一株具有黄精糖类物质高效利用能力的益生菌青春双歧杆菌，并以黄精粉末为唯一碳源进行定向厌氧发酵，结合分级醇沉和柱层析纯化工艺，获得重均分子量为4.850×103 da、数均分子量为3.570×103 da、果糖含量高达94.32%的低分子量黄精果聚糖；该低分子量黄精果聚糖能够显著提高肠道菌群的物种丰富度和多样性，调节菌群群落结构，促进特定有益菌的增殖，从而有效改善肠道微生态失衡。本申请实现了黄精糖类结构的定向调控，为功能性益生元产品的开发提供了新的技术方案。

2、为达到上述目的，本申请提供了如下技术方案：

3、第一方面，本申请提供了一种发酵来源低分子量黄精果聚糖的制备方法，包括以下步骤：

4、将益生菌青春双歧杆菌接种于以黄精粉末为唯一碳源的发酵培养基中进行厌氧发酵，得到黄精发酵液；

5、对所述黄精发酵液进行固液分离，收集上清液；

6、将所述上清液进行分级醇沉，收集多糖沉淀，经干燥获得黄精粗多糖；

7、将所述黄精粗多糖依次进行离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，收集目标多糖峰对应馏分，干燥后获得低分子量黄精果聚糖。

8、在某些实施方式中，所述厌氧发酵的条件为：接种量5%（v/v），培养温度37 ℃，初始ph 7.0，严格厌氧培养，发酵时间12 h。

9、在某些实施方式中，所述分级醇沉包括：将发酵上清液浓缩后，加入无水乙醇至终浓度40%（v/v），于4 ℃静置后离心去除沉淀，向上清中继续加入无水乙醇至终浓度80%（v/v），于4 ℃静置后离心，收集多糖沉淀。

10、在某些实施方式中，所述离子交换层析为deae-52离子交换柱层析，具体包括：将黄精粗多糖溶解后上样于deae-52离子交换柱，依次采用去离子水、0.1 mol/l、0.2 mol/l、0.3 mol/l、0.4 mol/l和0.5 mol/l nacl溶液进行梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，根据洗脱曲线收集主峰对应馏分。

11、在某些实施方式中，所述梯度洗脱的流速为10 ml/min。

12、在某些实施方式中，所述凝胶过滤层析为sephadex g-75凝胶柱层析，具体包括：将离子交换层析纯化后的多糖组分溶解后上样于sephadex g-75凝胶柱，以去离子水为流动相进行等度洗脱，流速为1 ml/min，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，根据洗脱曲线收集主峰对应馏分。

13、第二方面，本申请提供了一种低分子量黄精果聚糖，其由第一方面所述的制备方法制得。

14、在某些实施方式中，所述低分子量黄精果聚糖的重均分子量为4.850×103 da，数均分子量为3.570×103 da，多分散系数为1.358；且其单糖组成中果糖相对含量为94.32%，葡萄糖含量为2.88%，甘露糖含量为2.80%。

15、第三方面，本申请提供了第二方面所述的低分子量黄精果聚糖在制备调节肠道菌群的药物或功能性食品中的应用。

16、在某些实施方式中，所述调节肠道菌群包括以下作用中的至少一种：

17、（a）提高肠道菌群的物种丰富度和群落多样性，包括提高chao1指数、observedotus指数和shannon指数；

18、（b）调节肠道菌群群落结构，使疾病状态下的菌群结构向正常方向偏移；

19、（c）在门水平上提高放线菌门和拟杆菌门的相对丰度，降低厚壁菌门的相对丰度；

20、（d）在科水平上提高双歧杆菌科和穆里巴库菌科的相对丰度；

21、（e）在属水平上提高双歧杆菌属和穆里巴库菌属的相对丰度，降低布劳特氏菌属的相对丰度。

22、第四方面，本申请提供了一种调节肠道菌群的功能性产品，其包含第二方面所述的低分子量黄精果聚糖和食品学上或药学上可接受的载体或辅料。

23、与现有技术相比，本申请至少具备以下有益效果：

24、本申请利用益生菌青春双歧杆菌对黄精粉末进行定向厌氧发酵，反应条件温和，无需强酸强碱处理，发酵周期短，结合分级醇沉和柱层析纯化工艺，获得重均分子量为4.850×103da、数均分子量为3.570×103da、多分散系数为1.358、果糖含量高达94.32%的低分子量黄精果聚糖，克服了传统黄精多糖分子量高、分布宽、结构不明确的技术缺陷；动物实验表明，该低分子量黄精果聚糖能够显著提高肾损伤模型小鼠肠道菌群的物种丰富度和多样性，使疾病状态下的菌群结构向正常方向偏移，并在门、科、属水平上选择性调节菌群组成，显著提高放线菌门、拟杆菌门、双歧杆菌科及双歧杆菌属和穆里巴库菌属等有益菌群的相对丰度，具有显著的益生元功能，为黄精资源的深加工利用及肠道菌群调节功能性产品的开发提供了新的技术方案。

1.一种发酵来源低分子量黄精果聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述厌氧发酵的条件为：接种量5%（v/v），培养温度37 ℃，初始ph 7.0，严格厌氧培养，发酵时间12 h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分级醇沉包括：将发酵上清液浓缩后，加入无水乙醇至终浓度40%（v/v），于4 ℃静置后离心去除沉淀，向上清中继续加入无水乙醇至终浓度80%（v/v），于4 ℃静置后离心，收集多糖沉淀。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换层析为deae-52离子交换柱层析，具体包括：将黄精粗多糖溶解后上样于deae-52离子交换柱，依次采用去离子水、0.1 mol/l、0.2 mol/l、0.3 mol/l、0.4 mol/l和0.5 mol/l nacl溶液进行梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，根据洗脱曲线收集主峰对应馏分；所述梯度洗脱的流速为10ml/min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶过滤层析为sephadex g-75凝胶柱层析，具体包括：将离子交换层析纯化后的多糖组分溶解后上样于sephadex g-75凝胶柱，以去离子水为流动相进行等度洗脱，流速为1 ml/min，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，根据洗脱曲线收集主峰对应馏分。

6.一种低分子量黄精果聚糖，其特征在于，由权利要求1-5任一所述的制备方法制得。

7.根据权利要求6所述的低分子量黄精果聚糖，其特征在于，所述低分子量黄精果聚糖的重均分子量为4.850×103 da，数均分子量为3.570×103 da，多分散系数为1.358；且其单糖组成中果糖相对含量为94.32%，葡萄糖含量为2.88%，甘露糖含量为2.80%。

8.权利要求6或7所述的低分子量黄精果聚糖在制备调节肠道菌群的药物或功能性食品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述调节肠道菌群包括以下作用中的至少一种：

10.一种调节肠道菌群的功能性产品，其特征在于，包含权利要求6或7所述的低分子量黄精果聚糖和食品学上或药学上可接受的载体或辅料。