增强三酮类HPPD抑制剂除草剂耐受性基因HHR1及其应用

本发明属于农药学以及植物学领域，更具体地，本发明涉及一种增强三酮类hppd抑制剂除草剂耐受性基因hhr1及其应用。

背景技术：

1、对羟苯基丙酮酸双氧化酶(hppd)抑制剂除草剂作为一种农药，通过抑制植物体内hppd酶活性，阻断酪氨酸转化为质体醌和生育酚的代谢途径，导致类胡萝卜素合成受阻，使杂草叶片失绿、白化并最终死亡。部分品种兼具土壤处理与茎叶处理功能(如异噁唑草酮)，通过根系吸收或叶面渗透发挥除草效果。与传统除草剂(如als抑制剂、accase抑制剂)无交互抗性，目前成为抗性杂草治理的重要工具。

2、三酮类hppd抑制剂除草剂对狗尾草、稗草、马唐、莎草等一年生禾本科及阔叶杂草具有较为高效除草效果。三酮类hppd抑制剂除草剂被应用于多种作物的除草。对于玉米：异噁唑草酮长期占据玉米田hppd抑制剂市场第二位，兼具高效除草与安全性。对于高粱：喹草酮为全球首个高粱田选择性除草剂，解决高粱杂草防控难题。对于水稻：三唑磺草酮、吡唑喹草酯等突破hppd抑制剂对水稻的安全性问题，有效防控抗性千金子。其它的作物还包括：小麦、甘蔗、棉花等。

3、三酮类hppd抑制剂除草剂覆盖多种抗性杂草，尤其对草甘膦抗性杂草效果显著。但是，其也还存在一定的缺陷或局限，比如土壤墒情不佳时，部分品种活性成分滞留表层，药效延迟；部分品种在低温或干旱条件下易引发药害等。

4、禾本科植物，例如水稻为世界上最重要的粮食作物之一，养育着全球半数以上的人口。随着世界人口的不断增加，气候不断恶化，自然灾害频繁发生，可用耕地和水资源的日益减少，导致粮食短缺的问题将愈发严重。而杂草与作物竞争水分、光照、空气和土壤中的养分等资源并传播害虫和病菌，成为作物减产的重要生物因素之一。目前田间杂草的防治主要有三种方法：人工防治、生物防治和化学防治。与成本较高的人工防治和效果不稳定的生物防治相比，化学防治依然是目前最为有效且应用广泛的杂草防治方式。而某些除草剂对作物本身具有毒害作用，这极大地限制了除草剂的有效使用。因此，迫切需要开发新的除草剂抗性基因以提高作物对除草剂的抗性。

5、对羟苯基丙酮酸双氧化酶(hppd)抑制剂除草剂通过抑制植物的hppd活性，阻碍羟基苯基丙酮酸转化为尿黑素，影响生育酚和质体醌的正常合成，进而影响植物体内类胡萝卜素的生物合成，最终导致植株白化直至死亡。双环磺草酮(benzobicyclon，bbc)是一个三酮类hppd抑制剂类的除草剂，在田间显示出对其他种类除草剂抗性的杂草具有良好的杀伤效果。但是bbc对籼稻不安全，仅能用于部分粳稻品种，且施用浓度较低。

6、因此，需要寻找三酮类hppd抑制剂除草剂的抗性基因，增强植物对三酮类hppd抑制剂除草剂的耐受性，便于除草剂的良好使用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种增强三酮类hppd抑制剂除草剂耐受性基因hhr1及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种增强植物对三酮类4-对羟苯基丙酮酸双氧化酶(三酮类hppd)抑制剂除草剂的耐受性的方法，包括：在植物中加强hhr1的表达或活性；其中，所述hhr1是氨基酸序列第253位残基为tyr的hhr1。

3、在一种或多种优选方式中，编码所述hhr1的基因为含有hhr1的基因组dna(ghhr1)(如染色体上的一段dna)或含有hhr1编码区(仅编码区)dna的基因；较佳地，所述hhr1编码区(仅编码区)dna的第758位为碱基a(也即，编码所述tyr的密码子为tac，也包括其简并序列)；较佳地，所述hhr1包括loc_os02g17940所定义的酶；较佳地，所述hhr1包括非洲野生稻(bart，o.barthii)来源的hhr1。

4、在一种或多种优选方式中，所述在植物中加强hhr1的表达或活性包括：将含有hhr1的基因组dna(ghhr1)(如染色体上的一段dna)或含有hhr1编码区(仅编码区)dna的基因的表达构建物或载体引入植物中；较佳地，所述hhr1的基因组dna(ghhr1)包括：hhr1启动子和基因编码区(位于启动子下游)。

5、在一种或多种优选方式中，所述hhr1包括：(i)seq id no:8所示氨基酸序列的蛋白；(ii)氨基酸序列与seq id no:8所示氨基酸序列的同源性≥80％且第253位残基保守地为tyr，具有所述增强耐受性功能的由(i)衍生的蛋白；或(iii)在seq id no:8所示氨基酸序列的蛋白的n或c末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的蛋白。

6、在一种或多种优选方式中，所述hhr1编码区具有seq id no:7或seq id no:5所示的核苷酸序列；或与seq id no:7或seq id no:5所示的多核苷酸序列具有70％以上(较佳地75％以上，80％以上或85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性(编码同功能蛋白)。

7、在一种或多种优选方式中，所述启动子具有seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6所示的多核苷酸序列具有70％以上(较佳地75％以上，80％以上或85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有同样的驱动表达功能。

8、在一种或多种优选方式中，所述的启动子或基因区包括它们的具有相同功能的同源基因。

9、在一种或多种优选方式中，所述方法中，将来自非洲野生稻(bart，o.barthii)的hhr1基因组dna或hhr1编码区基因引入到植物中。

10、在本发明的另一方面，提供一种hhr1、编码其的基因或含有所述基因的表达构建体的用途，用于增强植物对三酮类hppd抑制剂除草剂的耐受性；其中，所述hhr1是氨基酸序列第253位残基为tyr的hhr1；较佳地，编码所述hhr1的基因为含有hhr1的基因组dna(ghhr1)(如染色体上的一段dna)或含有hhr1编码区(仅编码区)dna的基因；较佳地，所述hhr1编码区(仅编码区)dna的第758位为碱基a(也即，编码所述tyr的密码子为tac，也包括其简并序列)；较佳地，所述hhr1包括loc_os02g17940所定义的酶；较佳地，所述hhr1包括非洲野生稻(bart，o.barthii)来源的hhr1。

11、在一种或多种优选方式中，所述植物为表达hhr1或其同源基因的植物；较佳地，所述植物包括禾本科植物或豆科植物，或所述hhr1或其同源基因来自禾本科植物或豆科植物；较佳地，所述禾本科植物包括(但不限于)：稻属、玉蜀黍属、小麦属，大麦属、黑麦属、芒属、黍属、芦苇属、高粱属，或所述豆科植物包括(但不限于)：大豆。

12、在一种或多种优选方式中，所述禾本科植物包括(但不限于)：水稻，玉米，小麦，大麦、黑麦、miscanthus_floridulus、黍、芦苇、高粱、粟、燕麦、谷、二穗短柄草等。

13、在一种或多种优选方式中，所述三酮类hppd抑制剂除草剂包括双环磺草酮(benzobicyclon，bbc)、苯唑草酮、环磺酮、环吡氟草酮和硝磺草酮。

14、在本发明的另一方面，提供植物hhr1、编码其的基因(hhr1)的用途，用于鉴定植物对对三酮类hppd抑制剂除草剂的耐受性。

15、在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物对三酮类hppd抑制剂除草剂的耐受性的方法，包括：分析植物hhr1、或编码其的基因(hhr1)；若所述hhr1的氨基酸序列第253位残基为tyr、或编码其的基因编码区(仅编码区)dna的第758位为碱基a(也即，编码所述tyr的密码子为tac)，则所述植物具有耐受性(耐受性强)；若所述hhr1的氨基酸序列第253位残基非tyr(如为ser)、或编码其的基因编码区(仅编码区)dna的第758位非碱基a(如为c)(也即，编码所述ser的密码子为tcc)，则所述植物耐受性低(或对于所述除草剂敏感)。

16、在一种或多种优选方式中，采用包括：测序法，pcr扩增法，限制性酶切分析法，探针法，杂交法，芯片法，等位基因多态性分析法进行核酸序列的鉴定。

17、在本发明的另一方面，提供一种对植物进行优化育种的方法，包括：以前面所述的方法鉴定植物对对三酮类hppd抑制剂除草剂的耐受性；当所述hhr1的氨基酸序列第253位残基非tyr(如为ser)、或编码其的基因编码区(仅编码区)dna的第758位非碱基a(如为c)，则改造该植物，将其hhr1的氨基酸序列第253位残基改造为tyr、或将编码其的基因编码区(仅编码区)dna的第758位改造为碱基a，从而提高植物耐受性。

18、在一种或多种优选方式中，进行改造的方法包括(但不限于)以下技术：定点突变、基因编辑(如crispr/cas技术)或同源重组；或在植物中调控hhr1基因的表达或活性，使得hhr1的氨基酸序列第253位残基为tyr的hhr1的表达或活性增强。

19、在本发明的另一方面，提供一种分离的hhr1(变体)蛋白，其包括：(i)seq id no:8所示氨基酸序列的蛋白；(ii)氨基酸序列与seq id no:8所示氨基酸序列的同源性≥80％且第253位残基保守地为tyr，具有所述增强耐受性功能的由(i)衍生的蛋白；或(iii)在seqid no:8所示氨基酸序列的蛋白的n或c末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的蛋白。

20、在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其包括：具有seq id no:7或seqid no:5所示的核苷酸序列的多核苷酸；或与seq id no:7或seq id no:5所示的多核苷酸序列具有70％以上(较佳地75％以上，80％以上或85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性(编码同功能蛋白)的多核苷酸。

21、在一种或多种优选方式中，所述多核苷酸还包括启动子，所述启动子：具有seq idno:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6所示的多核苷酸序列具有70％以上(较佳地75％以上，80％以上或85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有同样的驱动表达功能。

22、在本发明的另一方面，提供一种植物的细胞、组织或器官，其中包括：外源的hhr1基因组dna或hhr1编码区基因，或含有其的表达构建物或载体；其中，所述hhr1基因组dna或hhr1编码区基因编码的hhr1蛋白为氨基酸序列第253位残基为tyr的hhr1蛋白。

23、在一种或多种优选方式中，所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖为成体植物的能力。

24、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。