用于VTE相关基因的引物和探针组合物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及vte相关基因分型，具体涉及一种用于vte相关基因的引物和探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism，vte）包括深静脉血栓形成（dvt）与肺栓塞（pulmonary embolism，pe）。深静脉血栓是在深静脉中形成的血块（血栓），主要发生在腿部，症状包括疼痛、压痛、红斑和受影响腿部肿胀。当部分或全部血栓脱落（栓塞）并向上移动到肺部阻塞肺动脉时，就会发生肺动脉栓塞，具有高发病率、高致残率与高死亡率。癌症患者发生静脉血栓栓塞（vte）的风险正在稳步增加，是普通人群的9倍。根据癌症类型、分期、治疗方法和非癌症相关的静脉血栓栓塞危险因素，该风险在第一年的0.5%-20%之间变化。血栓形成前基因突变对静脉血栓栓塞发展的贡献已经得到了很好的证实。例如：thbdc.-151g>t联合proc c.565c>t（使vte风险增加6.06倍）和proc c.574_576dup/del（使vte风险增加6.06倍）能解释中国人群中约10%的vte事件。

2、关于血栓形成前基因变异的数据被合并到多基因静脉血栓栓塞风险评分中，该评分在加权连续评分中反映了个体对静脉血栓栓塞的遗传易感性。由于多基因静脉血栓栓塞风险评分在癌症病程中不会改变，因此它们可能有助于选择静脉血栓栓塞高风险的癌症患者，从而更好地指导血栓预防的决策。最近的研究也证实了此观点的成立，在该研究中发现：多基因风险评分可独立于癌症类型识别vte高风险患者。对高危人群进行基因检测，有助于做好预防工作并为个性化抗凝治疗提供依据。

3、针对snp检测，目前主流的方法包括核酸测序、扩增阻滞突变法（arms-pcr）及高分辨率熔解曲线法（hrm）、熔解曲线探针法等，其中，核酸测序虽为单点突变确证的“金标准”，但存在检测周期长的局限性。arms-pcr法虽检测速度快，但单管多重检测能力有限，且假阳性控制高度依赖于严苛的引物设计。高分辨率熔解曲线分析（high resolution meltinganalysis，hrm）是基于实时荧光定量pcr、无需特异性探针的核酸序列变异检测技术，pcr扩增完成后，对扩增子进行精细梯度升温，通过饱和dna结合染料荧光变化，精准区分dna双链解链行为差异，识别碱基突变、snp、插入缺失、甲基化等序列改变；这种方法能够通过全封闭反应体系显著降低扩增产物气溶胶污染，但是该方法的技术底层非常依赖饱和染料的温度相关淬灭特性以及测控仪器的精度，例如，染料性能缺陷可直接抑制pcr扩增效率，同时压缩荧光信号动态范围，降低体系检测灵敏度；染料非特异性淬灭与仪器温度、信号采集误差叠加，会扭曲熔解曲线轮廓、偏移熔解温度计算值，不仅降低检测结果准确度，还会抹平不同基因型间的特征信号差异，严重削弱变异分型特异性，导致hrm的分辨率受限，对于tm值变化极其微小的位点往往无法准确区分具体的变异类型。熔解曲线探针法是序列特异性探针介导的闭管分型技术，先通过不对称pcr富集单链靶核酸，再升温采集探针-靶标杂交双链解离的荧光信号，依靠探针与模板匹配度差异带来的tm差值区分野生型和突变基因型，其依托位点特异性荧光探针杂交解离信号实现基因分型，不受扩增子gc分布、非特异性扩增产物干扰，检测结果几乎不依赖染料温度淬灭特性与仪器温控精度，分型特异性与稳定性显著优于hrm；在实际中，引物与探针的设计质量直接决定熔解曲线探针法snp检测的灵敏度、检测准确度及分型特异性；但是，对于vte相关致病基因的snp检测，现有技术缺乏能够高灵敏度、高准确度和高特异性检测vte相关基因的引物和探针组合物，亟待解决。

技术实现思路

1、本发明第一方面为解决上述技术问题，提供了一种用于vte相关基因的引物和探针组合物，该组合物可在单管中实现多个vte基因位点的基因分型，不仅具有操作简单、耗时短，检测效率高等优点，而且检测灵敏度、检测准确性以及分型特异性均十分优异。

2、一种用于vte相关基因的引物和探针组合物，包括针对proc基因rs146922325位点的第一引物对和第一荧光探针，所述第一引物对包括一条劣势引物和一条优势引物，所述劣势引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述优势引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述第一荧光探针的核苷酸序列如seq id no:3所示；针对apoh基因rs52797880位点的第二引物对和第二荧光探针，所述第二引物对包括一条劣势引物和一条优势引物，所述劣势引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述优势引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述第二荧光探针的核苷酸序列如seq id no:6所示；针对thbd基因rs16984852位点的第三引物对和第三荧光探针，所述第三引物对包括一条劣势引物和一条优势引物，所述劣势引物的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述优势引物的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述第三荧光探针的核苷酸序列如seq id no:9所示；以及针对serpinc1基因rs2227589位点的第四引物对和第四荧光探针，所述第四引物对包括一条劣势引物和一条优势引物，所述劣势引物的核苷酸序列如seq id no:10所示，所述优势引物的核苷酸序列如seq id no:11所示，所述第四荧光探针的核苷酸序列如seq id no:12所示。本方案所提提供的引物和探针组合物，适用于静脉血栓栓塞症（vte）相关致病基因的单核苷酸多态性（snp）检测，结合熔解曲线探针法，具有操作简便、检测周期短、检测效率高等优势；该引物和探针组合物，不仅能够在单反应管内同步实现proc基因rs146922325位点、apoh基因rs52797880位点、thbd基因rs16984852位点以及serpinc1基因rs2227589位点的基因分型，而且检测灵敏度、检测准确性以及分型特异性都十分优异，能够满足临床静脉血栓易感基因分型检测的应用需求。

3、进一步的，还包括针对f2基因rs1799963位点的第五引物对和第五荧光探针，所述第五引物对包括一条劣势引物和一条优势引物，所述优势引物的核苷酸序列如seq id no:13所示，所述劣势引物的核苷酸序列如seq id no:14所示，所述第五荧光探针的核苷酸序列如seq id no:15所示。在本方案中，增设针对f2基因rs1799963位点的不对称引物对及配套荧光探针，可与其余位点引物探针兼容于同一反应体系，实现f2基因rs1799963位点与其他vte风险基因同步分型，从而可以有效拓宽检测靶点覆盖，分型信号清晰、基因型区分效果佳。

4、进一步的，还包括针对f11基因rs2036914位点的第六引物对和第六荧光探针，所述第六引物对包括一条劣势引物和一条优势引物，所述劣势引物的核苷酸序列如seq idno:16所示，所述优势引物的核苷酸序列如seq id no:17所示，所述第六荧光探针的核苷酸序列如seq id no:18所示。在本方案中，增设针对f11基因rs2036914位点的不对称引物对及配套荧光探针，可与其余位点引物探针兼容于同一反应体系，实现f11基因rs2036914位点与其他vte风险基因同步分型，从而可以有效拓宽检测靶点覆盖，分型信号清晰、基因型区分效果佳。

5、进一步的，还包括针对fgg基因rs2066865位点的第七引物对和第七荧光探针，所述第七引物对包括一条劣势引物和一条优势引物，所述优势引物的核苷酸序列如seq idno:19所示，所述劣势引物的核苷酸序列如seq id no:20所示，所述第七荧光探针的核苷酸序列如seq id no:21所示。在本方案中，增设针对fgg基因rs2066865位点的不对称引物对及配套荧光探针，可与其余位点引物探针兼容于同一反应体系，实现fgg基因rs2066865位点与其他vte风险基因同步分型，从而可以有效拓宽检测靶点覆盖，分型信号清晰、基因型区分效果佳。

6、进一步的，还包括针对mthfr基因rs1801133位点的第八引物对和第八荧光探针，所述第八引物对包括一条劣势引物和一条优势引物，所述优势引物的核苷酸序列如seq idno:22所示，所述劣势引物的核苷酸序列如seq id no:23所示，所述第八荧光探针的核苷酸序列如seq id no:24所示。在本方案中，增设针对mthfr基因rs1801133位点的不对称引物对及配套荧光探针，可与其余位点引物探针兼容于同一反应体系，实现mthfr基因rs1801133位点与其他vte风险基因同步分型，从而可以有效拓宽检测靶点覆盖，分型信号清晰、基因型区分效果佳。

7、在实际中，将多组不对称引物和探针置于同一反应体系，容易产生引物竞争、扩增偏倚、非特异性扩增和荧光通道串扰，本发明第二方面为解决这一技术问题，进一步的，将上述针对8个位点的引物对和荧光探针分为两个反应单元，两个反应单元分别为第一反应单元和第二反应单元，其中，第一反应单元包括针对proc基因rs146922325位点、serpinc1基因rs2227589位点、fgg基因rs2066865位点以及mthfr基因rs1801133位点的引物对和荧光探针，第一反应单元用于实现单管四重检测；所述第二反应单元包括针对apoh基因rs52797880位点、thbd基因rs16984852位点、f2基因rs1799963位点以及f11基因rs2036914位点的引物对和荧光探针，所述第二反应单元用于实现单管四重检测。从而形成双管四重vte-snp分型技术方案，现有技术中，将多组不对称引物与荧光探针集中于单一pcr反应体系进行多位点snp同步分型时，随着引物、探针数量的增加，极易出现引物间底物竞争、扩增效率失衡、非特异性交叉结合扩增、荧光信号相互干扰以及熔解峰重叠串扰等一系列技术难题。其中，不对称扩增体系本身存在优势引物、劣势引物的浓度差异，多组不对称扩增体系共存时，扩增偏倚问题会被进一步放大，极易导致部分位点扩增受抑、基因型信号丢失、杂合子双峰区分模糊、荧光通道信号紊乱，最终造成多位点同步分型准确率大幅下降，无法实现8个vte关键snp位点的稳定、精准同步检测，严重限制了高通量vte易感基因分型的临床应用。针对上述现有技术存在的核心技术瓶颈，本发明创新性提出双管四重的分组分型体系，将8个vte相关snp位点的引物探针组合物进行合理化分组排布，划分为两个独立的单管四重反应单元：第一反应单元整合proc、serpinc1、fgg、mthfr四个位点的引物探针组合，第二反应单元整合apoh、thbd、f2、f11四个位点的引物探针组合，通过精准的位点分组搭配，从体系根源上解决了多组不对称扩增体系共存引发的技术缺陷。

8、此外，通过前期的实验可知，本发明通过特异性分组优化，规避了不同位点引物间的恶性底物竞争与交叉非特异扩增，平衡了各四重体系内的扩增效率，消除了多探针共存导致的荧光通道串扰与熔解峰重叠问题，有效矫正了多组不对称引物共存带来的扩增偏倚，使每一反应单元内的四组引物探针均可高效、特异性扩增目标片段。最终实现每份样本仅需两个反应单元即可一次性完成全部8个vte易感snp位点的精准分型，在单管四重的复杂体系下，仍可保证各位点熔解峰分离度优异、基因型信号清晰可辨、无信号干扰与分型错漏。相较于传统单管少量位点分型、多管分管检测或多位点共管紊乱分型的现有方案，本发明在大幅精简检测操作、缩减检测时长、降低样本与试剂消耗、提升检测通量的同时，极大提升了多位点同步分型的稳定性、特异性和准确率，克服了本领域长期存在的多重不对称pcr分型技术壁垒。

9、优选的，每个检测位点的优势引物与劣势引物的摩尔比为100:1～1:1。该摩尔比能够针对性解决多重不对称体系扩增偏倚不可控、位点扩增失衡、杂合峰分辨差的缺陷；该比值范围是结合双管四重复合体系特点，经大量梯度实验筛选得到的适配区间。通过可控调控上下游引物扩增效率差异，可根据不同位点序列特性灵活优化扩增偏倚程度，有效抑制多重体系引物竞争与非特异扩增，稳定熔解峰位置与峰型区分度，适配四组引物探针共存的复杂体系，显著提升多位点同步分型的通用性、稳定性与精准性。

10、优选的，在1～100μl反应体系中，每条优势引物的终浓度为0.1～1μm，每条劣势引物的终浓度为0.01～0.5μm，每条探针的终浓度为0.05～0.5μm。

11、多重不对称pcr分型体系普遍存在扩增竞争剧烈、扩增偏倚严重、非特异扩增增多及荧光串扰突出的技术难题。常规不对称引物配比仅适用于单重检测，参数多为宽泛经验设置，无法适配单管四重的复杂共存体系，极易出现位点扩增失衡、信号强弱差异大、杂合双峰模糊、熔解峰重叠等缺陷，导致多重分型体系稳定性差、准确率低，难以实现多位点同步精准检测。针对该现有技术问题，进一步，每个位点的优势引物储备液浓度为20 μm、加入量为0.5 μl；劣势引物储备液浓度为2 μm、加入量为0.5 μl；探针储备液浓度为20 μm、加入量为0.2 μl；在20 μl体系中，对应终浓度分别为0.5 μm、0.05 μm和0.2 μm。优势引物与劣势引物摩尔比为10:1。本发明进一步限定了适配双管四重分型体系的精准引物、探针浓度配比参数；在20μl反应体系中，严格限定优势引物终浓度0.5μm、劣势引物终浓度0.05μm、探针终浓度0.2μm，使优势引物与劣势引物摩尔比固定为10:1。该精准配比并非本领域常规实验可轻易获得，而是发明人经过多轮浓度梯度筛选、扩增平衡性调试及四重体系兼容性验证得到的最优组合，并非简单常规参数选择。该特定10:1不对称摩尔配比可精准调控各位点扩增效率，可控形成适度扩增偏倚，显著拉大野生型与突变型熔解峰温差，有效提升杂合子双峰分辨能力，避免基因型判读模糊。同时，统一标准化的引物、探针终浓度，能够平衡同一四重体系内四组引物的扩增竞争力，显著减弱引物间底物竞争，抑制非特异性扩增，有效解决多重体系下高活性位点压制低活性位点扩增的问题。匹配的探针浓度可降低荧光背景与通道串扰，保证信号稳定、区分度佳。该参数体系与前述双管四重位点分组结构形成协同增效，从反应架构和反应参数双重层面解决了多重不对称分型的行业痛点，使单管四重体系依然具备高特异性、高灵敏度与高分型准确率，大幅提升检测通量、降低样本与试剂消耗，相较于现有粗放型配比方案具备显著的技术进步。

12、优选的，所述探针的5'端连接相应荧光基团，3'端连接淬灭基团。

13、本发明第三方面要解决提供一种适配vte相关基因位点且综合检测性能优异的试剂盒的问题，进一步的，提供了一种用于vte相关基因的试剂盒，包括所述引物和探针组合物，以及相互分隔的反应液1和反应液2。在本方案中，通过在试剂盒中配置所述引物和探针组合物，使得该试剂盒适用于静脉血栓栓塞症（vte）相关致病基因的单核苷酸多态性（snp）检测；可单管同步完成多个vte相关基因snp位点分型，检测灵敏度高、分型准确、特异性强；操作流程简便、检测周期短，无需额外测序验证即可直接判读基因型，能够为临床静脉血栓栓塞症易感基因筛查提供标准化、高通量的检测工具，适配大规模人群vte风险分层与精准诊疗需求。

14、进一步的，还包括2×pcr mix、阴性对照品和/或阳性对照品。

15、进一步的，提供了一种所述的引物和探针组合物在制备用于vte相关基因snp分型的试剂或产品中的应用。

16、进一步的，提供了一种所述的试剂盒在制备用于vte相关基因snp分型的试剂或产品中的应用。

17、一种如权利要求1-5中任一所述的引物和探针组合物在制备用于vte相关基因snp分型的试剂或产品中的应用。

18、与现有技术相比，本发明提供的一种用于vte相关基因的引物和探针组合物、试剂盒及其应用，依托不对称pcr联合熔解曲线探针技术，可在单管中实现多个vte基因位点的基因分型，不仅具有操作简单、耗时短，检测效率高等优点，而且检测灵敏度、检测准确性以及分型特异性均十分优异，可充分满足临床静脉血栓易感基因大规模分型筛查的应用需求。