华蟾素或其活性成分组合在制备非疾病治疗目的的体外MCMs蛋白抑制剂中的应用

本发明属于生物化学试剂及蛋白相互作用调控试剂领域，具体涉及一种华蟾素或其活性成分组合在制备非疾病治疗目的的体外mcms蛋白抑制剂中的应用。

背景技术：

1、微小染色体维持蛋白（minichromosome maintenance proteins，mcms）是一类在真核生物dna复制起始和延伸过程中发挥核心作用的蛋白质家族。mcm2-7六聚体复合物作为dna复制解旋酶的核心组分，负责解开dna双链以启动复制叉的前进，是细胞周期从g1期进入s期的关键限速步骤。近年来的研究表明，mcms在多种恶性肿瘤组织中异常高表达，其表达水平与肿瘤的恶性程度、转移潜能及患者的不良预后呈显著正相关，已成为肿瘤生物治疗的新靶标。目前，已有研究尝试运用protac技术设计靶向mcms的小分子药物，以期通过降解mcms蛋白来抑制肿瘤生长。然而，关于mcms抑制剂的报道仍十分有限，全球范围内尚缺乏能够直接靶向mcms并进入临床研究的化合物。

2、华蟾素是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥皮的精制提取物，主要包含蟾毒灵、华蟾毒精、华蟾毒它灵等蟾毒内酯类化合物以及吲哚生物碱类成分。近年来，国内外学者围绕华蟾素的抗肿瘤作用机制开展了大量研究，揭示了其多靶点、多通路的调控特征，如通过调控pi3k/akt、mapk、wnt/β-catenin等信号通路发挥抗肿瘤作用。但其直接的细胞内蛋白靶点尚未完全阐明，尚未见关于华蟾素直接靶向dna复制核心蛋白mcms的报道。目前，华蟾素与mcms蛋白之间的直接相互作用及其对mcms功能的影响仍属空白领域。

技术实现思路

1、本发明提供一种华蟾素或其活性成分组合在制备非疾病治疗目的的体外mcms蛋白抑制剂中的应用，旨在揭示华蟾素抗肿瘤的全新分子机制，并为开发以mcms为靶点的抗肿瘤药物或科研试剂提供新的先导化合物和理论依据。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种华蟾素或其活性成分组合在制备非疾病治疗目的的体外mcms蛋白抑制剂中的应用。通过将华蟾素或其活性成分组合应用于制备体外mcms蛋白抑制剂，能够直接抑制mcms蛋白，从而实现对细胞dna复制的精准干预。

4、作为优选，所述mcms蛋白包括mcm3、mcm5或mcm7中的至少一种。通过限定mcms蛋白的具体类型为mcm3、mcm5或mcm7，能够更加精准地发挥华蟾素及其活性成分组合的抑制作用，因为实验数据表明华蟾素对这三个蛋白的降解效果最为明显。

5、作为优选，所述体外mcms蛋白抑制剂为mcms蛋白降解剂；所述应用具体为：通过抑制mcms蛋白与其分子伴侣mcmbp蛋白的相互作用，促进mcms蛋白通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。通过这种抑制蛋白质-蛋白质相互作用（ppi），能够有效地破坏mcms复合物的稳定性，进而促进mcms蛋白降解，最终抑制dna复制的起始和延伸过程。

6、作为优选，所述华蟾素的活性成分组合为蟾毒内酯类化合物，是由蟾毒灵（bufalin）、华蟾毒精（cinobufagin）、华蟾毒它灵（cinobufotalin）、脂蟾毒配基（resibufogenin）、蟾毒它灵（bufotalin）、去乙酰华蟾毒精（deacetylcinobufagin）、蟾毒它里定（bufotalidin）、远华蟾毒精（arenobufagin）、日蟾毒它灵（gamabufotalin）、海蟾毒精（marinobufagin）、脂蟾毒精（resibufagin）的11种单体化合物组成。

7、作为优选，所述活性成分组合中各单体化合物的摩尔比为 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1。

8、作为优选，所述活性成分组合通过作用mcmbp蛋白不同氨基酸残基，在体外竞争性阻断mcms与mcmbp的相互作用。通过这种直接结合mcmbp蛋白并竞争性阻断的机制，能够高效地抑制mcmbp-mcms相互作用，发挥体外生化实验中的靶向抑制效果。这种活性成分组合可作为靶向mcmbp-mcms蛋白相互作用界面的小分子抑制剂。这一作用模式为本发明首次揭示，现有技术中华蟾素及其活性成分的抗肿瘤机制主要涉及诱导凋亡、调节免疫、逆转多药耐药等，尚未见关于靶向mcmbp-mcms相互作用的报道。

9、作为优选，所述体外mcms蛋白抑制剂为用于细胞生物学研究的科研试剂或体外生化检测试剂盒。通过明确最终的工业产品形态为科研试剂或试剂盒，能够满足体外研究和生化检测的需求，具备良好的实用性。

10、一种华蟾素或其活性成分组合在制备用于非疾病治疗目的的体外细胞实验中降低 mcm3蛋白表达水平的科研试剂中的应用，所述活性成分组合由蟾毒灵、华蟾毒精、华蟾毒它灵、脂蟾毒配基、蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒精、蟾毒它里定、远华蟾毒精、日蟾毒它灵、海蟾毒精和脂蟾毒精组成。

11、作为优选，所述科研试剂还用于降低mcm5和/或mcm7蛋白表达水平。

12、在所述的应用中，所述华蟾素或活性成分组合能够提高mcm3蛋白的泛素化水平，并降低mcmbp与mcm3的共免疫沉淀信号。所述活性成分组合能够与mcmbp蛋白结合，并降低mcmbp与mcm3蛋白的相互作用水平。

13、作为优选，在所述体外细胞实验中，各化合物的终浓度为 50-100 μm。

14、作为优选，所述体外细胞实验采用肝癌细胞。所述肝癌细胞为 hepg2 细胞。

15、作为优选，所述华蟾素在所述体外细胞实验中的处理浓度为 20-400 μg/ml。

16、一种用于体外细胞实验中研究mcm3蛋白表达调控的科研试剂盒，所述试剂盒包括：华蟾素或其活性成分组合、抗mcm3抗体，以及抗 mcmbp抗体和/或抗泛素抗体。所述试剂盒用于检测华蟾素或所述活性成分组合处理后细胞中 mcm3 蛋白表达水平、mcm3 蛋白泛素化水平或 mcmbp 与 mcm3 蛋白相互作用水平。

17、作为优选，所述试剂盒还包括细胞裂解液、免疫沉淀用protein a/g磁珠、westernblot检测试剂。

18、本发明的有益效果是：

19、实验证明华蟾素能够显著抑制肝癌细胞等肿瘤细胞的活力，但对正常肝细胞活力无明显影响，表明华蟾素对快速增殖的细胞（如肿瘤细胞）具有选择性抑制作用，而非无差别地杀伤所有细胞。这一特性使其有望克服传统细胞毒性药物的选择性不足问题，降低对正常组织的毒副作用。同时，本发明首次揭示华蟾素通过靶向mcmbp-mcms相互作用发挥作用，为华蟾素的抗肿瘤机制提供了全新的分子解释，也为开发以mcms为靶点的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物和研究方向。

20、本发明所述华蟾素抑制mcms蛋白的作用机制，进一步包括：华蟾素通过干预mcms复合物的组装过程，破坏mcm2-7六聚体复合物的稳定性，从而抑制dna复制解旋酶的活性，阻断肿瘤细胞的dna复制和增殖。

21、本发明所述活性成分与mcmbp蛋白的结合模式，蟾毒灵（bufalin）和脂蟾毒配基（resibufogenin）等蟾毒内酯类化合物通过其甾体母核上的特定官能团（如c14-β羟基、c16-乙酰氧基等）与mcmbp的疏水结合口袋相互作用，形成稳定的复合物。