一种dsRNA-纳米探针及孵育方法和在真菌中的应用

本发明具体涉及一种dsrna-纳米探针及孵育方法和在真菌中的应用。

背景技术：

1、基因沉默（rna silencing），又称rna干扰（rna interference，rnai）是真核生物中一种由rna介导的保守调节机制，是一种能以同源序列配对的形式靶向目标基因，在转录水平或转录后水平有效沉默或抑制目标基因表达的技术。经过20年的发展，rnai技术本身已处于成熟期。

2、目前，实现rnai的技术主要方式是通过设计并合成靶向目的基因的sirna序列，将目的基因片段克隆至载体中，完成重组载体构建，进一步将重组载体转染至宿主细胞中，获得重组质粒，最后利用抗性平板筛选阳性转化子并检测蛋白水平验证rna沉默效果。而载体介导的rnai技术具有沉默效率低下、易引发非特异性基因沉默、细胞转染效率低、筛选突变体过程中易存在假阳性结果等缺点，导致实验操作繁琐、周期长。

3、2011年有研究者利用大麦条纹花叶病毒介导的vigs表达体系，干扰小麦条锈病菌钙依赖磷酸酶亚基基因的表达，实现了对菌丝生长的有效抑制，但这种方法的稳定性和持久性较差，无法进行推广应用。

4、2016年，wang等在拟南芥和番茄中利用higs技术沉默灰霉菌的dcl基因，有效抑制了灰霉菌的生长，但灰霉病菌对裸dsrna吸收效率低，未加载体时基因沉默效率不足40%。

5、cn101935670a公开了一种多引物直接退火构建rna干扰载体的方法，虽然该方法无需合成引物、酶切回收、连接酶等处理，但是，仍需要依靠大肠杆菌体内连接形成重组质粒、菌落筛选、质粒抽提等操作，该技术较rna瞬时沉默，周期长、操作繁琐。

6、cn119876220a公开了一种真菌专用的双基因共沉默技术，采用双启动子分别驱动不同靶基因干扰片段，虽然实现了精准、同步的基因沉默，且依托农杆菌转化法提高了真菌中的转化效率，但是，该技术需完成干扰片段扩增、载体构建、农杆菌转化、真菌侵染、抗性筛选、阳性株验证等多步操作，仅载体构建与菌株筛选就需数周，后续还需培养验证沉默效果，整体周期长。

7、目前，通过喷洒dsrna也能实现瞬时沉默，可直接将合成的dsrna等导入菌体，数天内即可获得沉默结果，能快速验证基因功能，其实验流程为：选择生长状况良好且大小一致的样本，将孵育完的dsrna-纳米探针复合物置于小型喷洒器，使雾滴均匀喷洒至样本表面，每日定时观察样本变化，该方法具有实验周期短、易操作、成本低的优点。

8、通过喷洒dsrna实现瞬时沉默的研究已有诸多实例：李林燕等通过叶面喷洒目的基因dsrna，成功有效提升了小麦的直链淀粉含量；郝璇等则利用sio2-nps与tio2-nps组成的探针组合进行天竺葵叶面喷洒，探究了温度胁迫下天竺葵体内抗氧化酶基因及温度胁迫响应基因的表达变化，进而揭示了该探针提升植株抗逆性的分子机制。cn120555486a公开了一种用于改进植物的产量性状的多核苷酸分子的表面应用，通过对甘蓝型油菜、水稻喷洒对应dsrna后，定向改善作物的产量性状。cn119979534a公开了一种可通过rnai防治植物灰霉病菌的新型靶标分子tre1-dsrna的制备方法，为验证目的dsrna对灰霉病菌侵染植物的实际防治效果，开展了烟草叶片活体防治的rna喷洒实验。

9、虽然rna喷洒实验在植物中应用效果显著，但是，仍然需要解决菌种对裸dsrna吸收效率低，基因沉默效率不高等问题，特别是在大型真菌中未见基因沉默相关报道。

10、综上，亟待找到一种细胞摄取、递送、胞内释放dsrna效率高，具有高效实现沉默靶基因功能的dsrna-纳米探针，操作简便，条件温和、易控，促进纳米探针与dsrna高效包裹、快速结合的孵育方法，以及以喷洒方式，无需细胞转染、长期筛选或单克隆培养，即可快速触发rnai抑制靶基因的表达，高效实现沉默目标基因，实验周期短，操作成本低，适用范围广的dsrna-纳米探针在真菌中的应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种细胞摄取、递送、胞内释放dsrna效率高，具有高效实现沉默靶基因功能的dsrna-纳米探针。

2、本发明进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种操作简便，条件温和、易控，促进纳米探针与dsrna高效包裹、快速结合的dsrna-纳米探针的孵育方法。

3、本发明更进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种以喷洒方式，无需细胞转染、长期筛选或单克隆培养，即可快速触发rnai抑制靶基因的表达，高效实现沉默目标基因，实验周期短，操作成本低，适用范围广的dsrna-纳米探针在真菌中的应用。

4、本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种dsrna-纳米探针，主要由dsrna和纳米探针孵育复合而成；所述dsrna由靶基因编码区的目标sirna序列合成；所述纳米探针包括β-环糊精和/或l-精氨酸，或还有nh4f与碱水溶液的复合溶液。更优选地，所述探针包括β-环糊精、l-精氨酸、β-环糊精+l-精氨酸或β-环糊精+l-精氨酸+nh4f与碱水溶液的复合溶液。

5、本发明的发明思路为：纳米探针在基因瞬时沉默实验中作为递送dsrna的载体，dsrna在基因瞬时沉默实验中通过序列特异性降解靶基因，快速实现基因瞬时沉默，通过特定纳米探针快速载入dsrna，解决了dsrna易降解、难入细胞的痛点。β-环糊精（简称β-cd）具有外亲水、内疏水的刚性环状空腔结构，能够通过包和作用实现对疏水性目标分子的选择性识别。l-精氨酸（简称l-arg）含有强碱性胍基，带强正电荷且具有强氢键能力，与带负电荷的细胞膜及磷酸骨架结合得更牢，且l-arg可直接穿膜促进dsrna快速入胞，进入细胞后，内体通过质子海绵效应破坏膜结构，释放dsrna。nh4f中的f-可以增加膜流动性，使复合物更易进入细胞，nh4+在酸性环境中能吸收大量h+，降低ph值，膜结构破裂易于释放dsrna。

6、优选地，所述dsrna与纳米探针的体积比为1:1.0～1.5（更优选1:1.0～1.2）。

7、优选地，所述靶基因编码区的目标sirna序列是在靶基因编码区避开密码子邻近区域及保守结构域中，选取的连续21～23 bp的正向链和反向链rna序列。所述靶基因编码区可在ncbi上进行查询。目标sirna序列的确定可采用现有实验室通用的sirna靶点选取核心原则，或参考在线打分软件进行选取。正向链和反向链的rna序列交由生物合成公司进行引物合成。

8、例如，在对大型真菌进行基因瞬时沉默实验时，蛹虫草的dsrna可选取wc-1蛋白结构域中选取的连续21 bp的正向链和反向链的rna序列，wc-1蛋白结构域的表观功能是激活光诱导基因进而调控类胡萝卜素生成；灵芝的dsrna可选取mtor蛋白结构域中选取的连续21bp的正向链和反向链的rna序列，mtor蛋白结构域的表观功能是正向调控菌丝生长速率。

9、优选地，当所述纳米探针组分为β-环糊精+l-精氨酸时，其质量比为1:1.0～1.5（更优选1:1.0～1.3）。

10、优选地，当所述纳米探针组分为β-环糊精+l-精氨酸+nh4f时，其质量比为1～2:1～2:1（更优选1.2～1.8:1.2～1.8:1）。

11、优选地，所述β-环糊精和/或l-精氨酸，或还有nh4f与碱水溶液的质量体积比为1.0～1.6:5 g/ml。

12、优选地，所述碱水溶液的浓度为0.5～1.0 mol/l。

13、优选地，所述纳米探针的制备方法为：将β-环糊精和/或l-精氨酸，或还有nh4f分别或同时溶解于碱水溶液后，再置于密闭反应釜中，进行水热反应后，冷却至室温，即成。

14、优选地，所述水热反应的温度为180～240℃，时间为4～8 h。

15、本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种dsrna-纳米探针的孵育方法，将dsrna和纳米探针混合，超声孵育，即成。

16、优选地，所述超声孵育的超声频率为20 khz～45 khz，温度为20～28℃，时间为25～30 min。孵育过程中超声的高频震动会把dsrna团体打散，并且增强离心管内液体流动，让dsrna快速、均匀地吸附到纳米探针表面。在合适的超声频率、温度、时间下，能保证rna的完整度、二级结构状态及靶向杂交能力。

17、本发明更进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种dsrna-纳米探针在真菌中的应用，先将活化后的真菌菌种接种于菌丝培养基中，放入培养箱培养后，再向菌丝表面均匀喷洒所述dsrna-纳米探针的水溶液，盖上培养皿盖，封上封口膜，放入培养箱培养，实现基因瞬时沉默。

18、优选地，所述真菌包括微型真菌或大型真菌等。

19、优选地，所述大型真菌包括蛹虫草和/或灵芝等。

20、优选地，所述dsrna-纳米探针的水溶液中，dsrna-纳米探针与双蒸水的体积比为1:80～120。

21、优选地，所述蛹虫草菌种的培养条件为：在20～28℃下，避光静置培养6～8 d至生长阶段。

22、优选地，所述灵芝菌种的培养条件为：在25～28℃下，照光静置培养2～4 d至菌丝覆盖一半培养皿。

23、优选地，所述喷洒量为400～800 μl/20～60 cm2。更优选地，应用于蛹虫草时，每40～60cm2喷洒400～800μl；应用于灵芝时，每20～30cm2喷洒400～800μl。

24、优选地，所述喷洒dsrna-纳米探针的水溶液后，蛹虫草菌丝的培养条件为：在20～28℃下，照光静置培养2～4 d。

25、优选地，所述喷洒dsrna-纳米探针的水溶液后，灵芝菌丝的培养条件为：在25～30℃下，照光静置培养至菌丝长满培养皿。

26、本发明所使用的菌丝培养基为sda培养基。

27、本发明的有益效果如下：

28、（1）本发明dsrna-纳米探针细胞摄取、递送、胞内释放dsrna效率高，具有高效实现沉默靶基因功能；

29、（2）本发明dsrna-纳米探针的孵育方法操作简便，条件温和、易控，促进纳米探针与dsrna高效包裹、快速结合；

30、（3）本发明dsrna-纳米探针以喷洒方式，无需细胞转染、长期筛选或单克隆培养，即可直接进入菌丝细胞内，快速触发rnai抑制靶基因的表达，高效实现沉默目标基因，实验周期短，操作成本低，适用范围广；已在蛹虫草沉默wc-1基因抑制类胡萝卜素合成和灵芝沉默mtor基因抑制菌丝生长中验证有效。