羧肽酶B突变体及其应用的制作方法

本发明涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种羧肽酶b突变体及其应用。

背景技术：

1、羧肽酶b (carboxypeptidase b, cpb)，主要靶向切割碱性氨基酸，弱碱性条件下，对多肽末端精氨酸或赖氨酸有极强水解活性。在生物法合成多肽、胰岛素生产、疾病的诊断与治疗等领域，应用广泛。其在重组胰岛素合成途径中，是胰岛素原活化生产胰岛素的重要工具酶，其产量和活性的高低对胰岛素的生产发挥重要作用。

2、目前羧肽酶b的合成方法主要包括动物组织提取及以原核、真核方式的重组基因工程表达。由牛或猪等动物胰腺组织中丙酮提取，该方法产物成本高、含量低并且副产物混杂，存在病毒污染的潜在问题。而通过重组途径表达羧肽酶b(procarboxypeptidase b,pro cpb)，使用胰蛋白酶激活后获得活性羧肽酶b，方法操作安全，生产工艺稳定，但是酶活性较低，需要进一步提高以生产降低成本。

3、因此，制备获得酶活性较高的羧肽酶b，是羧肽酶b产业化应用中亟需解决的技术难题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种羧肽酶b突变体及其应用，以解决现有技术中羧肽酶b的酶活性较低的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种羧肽酶b突变体，上述羧肽酶b突变体包括：（a）以野生型羧肽酶b为基础发生突变的蛋白，上述突变选自如下任意一个或多个位点的突变：a191、r247、f173、a182、v188、r193、e208、m238、a239、s242、l244、e258、v259、r263、s264、e268或a274，上述野生型羧肽酶b包括未截短或n段截短的seq idno：1所示的蛋白；或（b）与（a）中限定的氨基酸序列具有70%以上同一性且具有羧肽酶b活性的蛋白质。

3、进一步地，上述（a）中，上述突变选自如下任意一种或多种突变：a191l、r247d、f173i、f173g、f173a、f173v、f173l、f173m、f173p、f173w、a182t、a182g、a182v、a182l、a182i、a182f、a182m、a182p、a182w、a182s、a182c、a182y、a182n、a182q、v188a、v188g、v188l、v188i、v188f、v188m、v188p、v188w、r193i、r193g、r193a、r193v、r193l、r193f、r193m、r193p、r193w、r193k、r193h、e208g、e208d、e208a、e208v、e208l、e208i、e208f、e208m、e208p、e208w、m238n、m238g、m238a、m238v、m238l、m238i、m238f、m238p、m238w、m238s、m238t、m238c、m238y、m238q、a239v、a239g、a239l、a239i、a239f、a239m、a239p、a239w、s242v、s242g、s242a、s242l、s242i、s242f、s242m、s242p、s242w、s242t、s242c、s242y、s242n、s242q、l244v、l244g、l244a、l244i、l244f、l244m、l244p、l244w、e258g、e258d、e258a、e258v、e258l、e258i、e258f、e258m、e258p、e258w、v259i、v259g、v259a、v259l、v259f、v259m、v259p、v259w、r263m、r263k、r263h、r263g、r263a、r263v、r263l、r263i、r263f、r263p、r263w、s264m、s264g、s264a、s264v、s264l、s264i、s264f、s264p、s264w、s264s、s264t、s264c、s264y、s264n、s264q、e268v、e268d、e268g、e268a、e268l、e268i、e268f、e268m、e268p、e268w、a274s、a274y、a274g或a274v，其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸。

4、进一步地，上述突变包括如下任意一种氨基酸突变：

5、a191l+r247d、a191l+r247d+f173i、a191l+r247d+f173g、a191l+r247d+f173a、a191l+r247d+f173v、a191l+r247d+f173l、a191l+r247d+f173m、a191l+r247d+f173p、a191l+r247d+f173w、a191l+r247d+a182t、a191l+r247d+a182g、a191l+r247d+a182v、a191l+r247d+a182l、a191l+r247d+a182i、a191l+r247d+a182f、a191l+r247d+a182m、a191l+r247d+a182p、a191l+r247d+a182w、a191l+r247d+a182s、a191l+r247d+a182c、a191l+r247d+a182y、a191l+r247d+a182n、a191l+r247d+a182q、a191l+r247d+v188a、a191l+r247d+v188g、a191l+r247d+v188l、a191l+r247d+v188i、a191l+r247d+v188f、a191l+r247d+v188m、a191l+r247d+v188p、a191l+r247d+v188w、a191l+r247d+r193i、a191l+r247d+r193g、a191l+r247d+r193a、a191l+r247d+r193v、a191l+r247d+r193l、a191l+r247d+r193f、a191l+r247d+r193m、a191l+r247d+r193p、a191l+r247d+r193w、a191l+r247d+r193k、a191l+r247d+r193h、a191l+r247d+e208g、a191l+r247d+e208d、a191l+r247d+e208a、a191l+r247d+e208v、a191l+r247d+e208l、a191l+r247d+e208i、a191l+r247d+e208f、a191l+r247d+e208m、a191l+r247d+e208p、a191l+r247d+e208w、a191l+r247d+m238n、a191l+r247d+m238g、a191l+r247d+m238a、a191l+r247d+m238v、a191l+r247d+m238l、a191l+r247d+m238i、a191l+r247d+m238f、a191l+r247d+m238p、a191l+r247d+m238w、a191l+r247d+m238s、a191l+r247d+m238t、a191l+r247d+m238c、a191l+r247d+m238y、a191l+r247d+m238q、a191l+r247d+a239v、a191l+r247d+a239g、a191l+r247d+a239l、a191l+r247d+a239i、a191l+r247d+a239f、a191l+r247d+a239m、a191l+r247d+a239p、a191l+r247d+a239w、a191l+r247d+s242v、a191l+r247d+s242g、a191l+r247d+s242a、a191l+r247d+s242l、a191l+r247d+s242i、a191l+r247d+s242f、a191l+r247d+s242m、a191l+r247d+s242p、a191l+r247d+s242w、a191l+r247d+s242t、a191l+r247d+s242c、a191l+r247d+s242y、a191l+r247d+s242n、a191l+r247d+s242q、a191l+r247d+l244v、a191l+r247d+l244g、a191l+r247d+l244a、a191l+r247d+l244i、a191l+r247d+l244f、a191l+r247d+l244m、a191l+r247d+l244p、a191l+r247d+l244w、a191l+r247d+e258g、a191l+r247d+e258d、a191l+r247d+e258a、a191l+r247d+e258v、a191l+r247d+e258l、a191l+r247d+e258i、a191l+r247d+e258f、a191l+r247d+e258m、a191l+r247d+e258p、a191l+r247d+e258w、a191l+r247d+v259i、a191l+r247d+v259g、a191l+r247d+v259a、a191l+r247d+v259l、a191l+r247d+v259f、a191l+r247d+v259m、a191l+r247d+v259p、a191l+r247d+v259w、a191l+r247d+r263m、a191l+r247d+r263k、a191l+r247d+r263h、a191l+r247d+r263g、a191l+r247d+r263a、a191l+r247d+r263v、a191l+r247d+r263l、a191l+r247d+r263i、a191l+r247d+r263f、a191l+r247d+r263p、a191l+r247d+r263w、a191l+r247d+s264m、a191l+r247d+s264g、a191l+r247d+s264a、a191l+r247d+s264v、a191l+r247d+s264l、a191l+r247d+s264i、a191l+r247d+s264f、a191l+r247d+s264p、a191l+r247d+s264w、a191l+r247d+s264s、a191l+r247d+s264t、a191l+r247d+s264c、a191l+r247d+s264y、a191l+r247d+s264n、a191l+r247d+s264q、a191l+r247d+e268v、a191l+r247d+e268d、a191l+r247d+e268g、a191l+r247d+e268a、a191l+r247d+e268l、a191l+r247d+e268i、a191l+r247d+e268f、a191l+r247d+e268m、a191l+r247d+e268p、a191l+r247d+e268w、a191l+r247d+a274s、a191l+r247d+a274y、a191l+r247d+a274g、a191l+r247d+a274v、a191l+r247d+m238n+s242v、a191l+r247d+m238n+l244v、a191l+r247d+m238n+l244i、a191l+r247d+m238n+v259i、a191l+r247d+m238n+v259l、a191l+r247d+m238n+r263m、a191l+r247d+m238n+s264m、a191l+r247d+m238n+e268v、a191l+r247d+m238n+a274s、a191l+r247d+m238n+a274y、a191l+r247d+s242v+l244v、a191l+r247d+s242v+l244i、a191l+r247d+s242v+v259i、a191l+r247d+s242v+v259l、a191l+r247d+s242v+r263m、a191l+r247d+s242v+s264m、a191l+r247d+s242v+e268v、a191l+r247d+s242v+a274s、a191l+r247d+s242v+a274y、a191l+r247d+l244v+v259i、a191l+r247d+l244v+v259l、a191l+r247d+l244v+r263m、a191l+r247d+l244v+s264m、a191l+r247d+l244v+e268v、a191l+r247d+l244v+a274s、a191l+r247d+l244v+a274y、a191l+r247d+l244i+v259i、a191l+r247d+l244i+v259l、a191l+r247d+l244i+r263m、a191l+r247d+l244i+s264m、a191l+r247d+l244i+e268v、a191l+r247d+l244i+a274s、a191l+r247d+l244i+a274y、a191l+r247d+v259i+r263m、a191l+r247d+v259i+s264m、a191l+r247d+v259i+e268v、a191l+r247d+v259i+a274s、a191l+r247d+v259i+a274y、a191l+r247d+v259l+r263m、a191l+r247d+v259l+s264m、a191l+r247d+v259l+e268v、a191l+r247d+v259l+a274s、a191l+r247d+v259l+a274y、a191l+r247d+r263m+s264m、a191l+r247d+r263m+e268v、a191l+r247d+r263m+a274s、a191l+r247d+r263m+a274y、a191l+r247d+s264m+e268v、a191l+r247d+s264m+a274s、a191l+r247d+s264m+a274y、a191l+r247d+e268v+a274s、a191l+r247d+e268v+a274y、a191l+r247d+m238n+s242v+l244v、a191l+r247d+m238n+s242v+l244i、a191l+r247d+m238n+s242v+v259i、a191l+r247d+m238n+s242v+r263m、a191l+r247d+m238n+s242v+s264m、a191l+r247d+m238n+l244v+v259i、a191l+r247d+m238n+l244v+r263m、a191l+r247d+m238n+l244v+s264m、a191l+r247d+m238n+l244i+v259i、a191l+r247d+m238n+l244i+r263m、a191l+r247d+m238n+l244i+s264m、a191l+r247d+m238n+v259i+r263m、a191l+r247d+m238n+v259i+s264m、a191l+r247d+m238n+r263m+s264m、a191l+r247d+s242v+l244v+v259i、a191l+r247d+s242v+l244v+r263m、a191l+r247d+s242v+l244v+s264m、a191l+r247d+s242v+l244i+v259i、a191l+r247d+s242v+l244i+r263m、a191l+r247d+s242v+l244i+s264m、a191l+r247d+s242v+v259i+r263m、a191l+r247d+s242v+v259i+s264m、a191l+r247d+s242v+r263m+s264m、a191l+r247d+l244v+v259i+r263m、a191l+r247d+l244v+v259i+s264m、a191l+r247d+l244v+r263m+s264m、a191l+r247d+l244i+v259i+r263m、a191l+r247d+l244i+v259i+s264m、a191l+r247d+l244i+r263m+s264m、a191l+r247d+v259i+r263m+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244v+v259i、a191l+r247d+m238n+s242v+l244v+r263m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244v+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244i+v259i、a191l+r247d+m238n+s242v+l244i+r263m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244i+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+v259i+r263m、a191l+r247d+m238n+s242v+v259i+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+r263m+s264m、a191l+r247d+m238n+l244v+v259i+r263m、a191l+r247d+m238n+l244v+v259i+s264m、a191l+r247d+m238n+l244v+r263m+s264m、a191l+r247d+m238n+l244i+v259i+r263m、a191l+r247d+m238n+l244i+v259i+s264m、a191l+r247d+m238n+l244i+r263m+s264m、a191l+r247d+s242v+l244v+v259i+r263m、a191l+r247d+s242v+l244v+v259i+s264m、a191l+r247d+s242v+l244v+r263m+s264m、a191l+r247d+s242v+l244i+v259i+r263m、a191l+r247d+s242v+l244i+v259i+s264m、a191l+r247d+s242v+l244i+r263m+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244v+v259i+r263m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244v+v259i+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244v+r263m+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244i+v259i+r263m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244i+v259i+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244i+r263m+s264m、a191l+r247d+m238n+l244v+v259i+r263m+s264m、a191l+r247d+m238n+l244i+v259i+r263m+s264m、a191l+r247d+s242v+l244v+v259i+r263m+s264m、a191l+r247d+s242v+l244i+v259i+r263m+s264m、a191l+r247d+m238n+s242v+l244v+v259i+r263m+s264m或a191l+r247d+m238n+s242v+l244i+v259i+r263m+s264m。

6、进一步地，上述n端截短的seq id no：1所示的蛋白包括：删除seq id no：1所示的上述野生型羧肽酶b的第1-第13个氨基酸或第2-第13个氨基酸所获得的蛋白。

7、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种dna分子，上述dna分子编码上述的羧肽酶b突变体。

8、为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种重组质粒，上述重组质粒含有上述的dna分子。

9、进一步地，上述重组质粒包括ppic9k或ppicza。

10、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，上述宿主细胞内含有上述的dna分子或上述的重组质粒。

11、进一步地，上述宿主细胞包括：酵母或大肠杆菌。

12、为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种目标产物的制备方法，上述制备方法包括：利用上述的羧肽酶b突变体，对底物进行催化，制备获得上述目标产物。

13、进一步地，上述底物包括胰高血糖素样肽-1类似物-赖氨酸-精氨酸单体，对应的，上述目标产物包括胰高血糖素样肽-1类似物前体。

14、进一步地，上述底物包括马脲酰-l-精氨酸，对应的，上述目标产物包括马尿酸。

15、为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种上述的羧肽酶b突变体、上述的dna分子、上述的重组质粒、上述的宿主细胞、或上述的制备方法在多肽合成中的应用。

16、进一步地，上述多肽合成包括：生物法合成多肽、胰岛素生产、制备马尿酸、靶向切割碱性氨基酸、或水解多肽末端精氨酸或赖氨酸。

17、应用本发明的技术方案，利用上述羧肽酶b突变体，能够实现高效对胰高血糖素样肽-1类似物-kr单体进行酶切以及对马脲酰-l-精氨酸进行水解的技术效果，较好地制备获得马尿酸或胰高血糖素样肽-1类似物前体。上述羧肽酶b突变体相较于野生型酶，在生物法合成多肽、胰岛素生产、制备马尿酸、靶向切割碱性氨基酸、或水解多肽末端精氨酸或赖氨酸的转化率和效率较高，高度契合现代制药工业对绿色、高效和安全生产的迫切需求。