一种单酶纳米凝胶包封漆酶及其制备方法与应用

本申请涉及酶固定化和环境生物催化，尤其涉及一种单酶纳米凝胶包封漆酶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、漆酶是一类含铜多酚氧化酶，能够以分子氧为末端电子受体，催化氧化多种酚类、芳香胺类及相关有机化合物，并将分子氧还原为水。基于上述催化特性，漆酶可用于造纸废水处理、生物漂白、染料脱色、食品加工和生物修复等场景。

2、在造纸废水和含木质素废液处理中，反应体系可能具有较高温度、偏酸或偏碱等工况。游离漆酶本质上属于蛋白质，其空间构象容易受到温度、ph、界面作用和溶液组分的影响，进而出现构象展开、聚集或活性中心环境改变，导致酶活力下降以及使用寿命缩短的情况。传统载体固定化方法通常将酶吸附、包埋或共价连接于微米级或宏观载体上，虽然能够改善酶的稳定性，但也可能引入载体传质阻力、酶负载不均以及载体表面非特异性失活等问题。单酶纳米凝胶技术通过在单个酶分子的外周形成纳米尺度交联网络，可在保持较短传质路径的同时对酶分子进行限域保护。

3、然而，现有单酶纳米凝胶包封漆酶仍存在表面功能化程度、聚合物壳层形成条件、纯化方式和壳层尺寸调控之间缺乏协同设计的问题，容易出现游离酶残留、无蛋白聚合物生成、壳层过度交联或活性回收率不足。

4、因此，有必要提供一种结构明确、制备条件可控且适用于水处理应用的单酶纳米凝胶包封漆酶及其制备方法。

技术实现思路

1、为解决现有技术中游离漆酶在偏酸、偏碱和较高温度条件下稳定性不足，以及现有包封体系中壳层结构和纯化过程不易控制的问题。本申请一方面提供一种单酶纳米凝胶包封漆酶，所述单酶纳米凝胶包封漆酶包括漆酶核心和包覆于所述漆酶核心外周的聚合物纳米凝胶壳层；所述漆酶核心的表面连接有可聚合不饱和基团；所述聚合物纳米凝胶壳层由丙烯酰胺和n,n′-亚甲基双丙烯酰胺在所述漆酶核心表面原位交联聚合形成。

2、进一步，所述漆酶为云芝漆酶，其初始酶活力不低于0.5 u/mg。

3、所述初始酶活力采用abts氧化法测定。具体地，以abts为反应底物，将适量漆酶样品加入含0.5 mmol/l abts的0.1 mol/l乙酸钠缓冲液中，所述乙酸钠缓冲液的ph为4.5；在30 ℃条件下反应，并连续测定反应体系在420 nm处的吸光度变化。以abts氧化产物在420nm处的摩尔消光系数3.6×104 l⋅mol−1⋅cm−1计算漆酶活力。一个酶活力单位（u）定义为在上述测定条件下，每分钟催化氧化1 μmol abts所需的酶量；初始比酶活以每毫克漆酶制剂所具有的酶活力表示，单位为u/mg。本申请实施例选用的云芝漆酶经上述方法测得的初始比酶活不低于0.5 u/mg。

4、进一步，步骤s1中，漆酶在碳酸钠缓冲液中的质量浓度为0.2-5.0 mg/ml，优选为2.0-5.0 mg/ml；按每1 mg漆酶加入0.2-5.0 ml碳酸钠缓冲液计量。n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺相对于漆酶表面可反应伯氨基的摩尔当量为10-30当量，优选为20当量。

5、进一步，步骤s2中，蔗糖在包封反应液中的终浓度为2%-10%（w/v），丙烯酰胺的终浓度为100-300 mm，n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的终浓度为15-50 mm，过硫酸铵的终浓度为5-30 mm；丙烯酰胺与n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为4:1-10:1，丙烯酰胺与过硫酸铵的摩尔比为8:1-20:1。

6、进一步，步骤s2中，氮气流量为20-100 ml/min，脱氧时间为30-60 min；原位聚合温度为20-25℃，振荡速度为80-200 r/min，聚合时间为1-3 h。

7、进一步，步骤s3中，透析温度为4-10℃，透析时间为12-36 h，样品与透析液体积比为1:50-1:200，换液3-6次；凝胶过滤的流速为0.2-1.0 ml/min，每管收集0.5-1.0 ml馏分。

8、另一方面，本申请还提供了一种如上述的单酶纳米凝胶包封漆酶的制备方法，包括以下步骤：

9、s1，将漆酶置于碳酸钠缓冲液中得到漆酶溶液，将漆酶溶液丙烯酰化，得到丙烯酰化漆酶；

10、所述丙烯酰化是利用n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对漆酶表面进行的

11、s2，在s1中得到的丙烯酰化漆酶溶液中加入丙烯酰胺、n,n′-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂和促进剂，得到包封反应液；

12、s3，对所述包封反应液进行透析和凝胶过滤纯化，获得单酶纳米凝胶包封漆酶。

13、进一步，所述步骤s2中，丙烯酰胺与n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为6∶1。

14、进一步，所述步骤s1中，碳酸钠缓冲液的浓度为20 mm，ph为9.15。

15、进一步，所述步骤s1中，将n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜中，并按每摩尔蛋白质赖氨酸残基对应20当量的n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺加入漆酶溶液。

16、进一步，所述步骤s2中，丙烯酰胺的终浓度为200 mm；n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的终浓度为33 mm。

17、进一步，所述漆酶溶液的浓度为3.3-58.4 μm。

18、进一步，在步骤s3中，先采用pbs透析去除低分子量组分，再采用sephadex g-75凝胶过滤去除未包封漆酶和无蛋白聚合物。

19、再一方面，本申请还提供了一种如上述的单酶纳米凝胶包封漆酶在制备造纸废水处理剂或木质素降解制剂中的应用。

20、有益效果

21、1、通过在单个漆酶分子外周构建亲水性交联纳米凝胶壳层，限制漆酶分子的过度构象展开和聚集，同时保留底物、氧气及产物的扩散通道；其在不同ph和温度条件下的剩余酶活力按照试验例所述方法测定，具体实测结果见表5；

22、2、通过先进行漆酶表面丙烯酰化，再在漆酶表面原位聚合，使聚合物壳层与漆酶核心之间形成稳定连接，有利于减少包封过程中酶分子的脱落；

23、3、在本申请的优选条件下，蔗糖终浓度为5%（w/v），丙烯酰化漆酶与丙烯酰胺的摩尔比约为1:6000，丙烯酰胺与n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比约为6:1，丙烯酰胺与过硫酸铵的摩尔比约为12:1，过硫酸铵与四甲基乙二胺的摩尔比约为1:1；该配方的活性回收率、粒径和稳定性结果见表3和表5；

24、4、所述种子蛋白是指步骤s1获得的丙烯酰化漆酶，其作为原位聚合的蛋白质核心和成核位点；在保持单体、交联剂和引发体系终浓度不变的条件下调节种子蛋白浓度，可改变蛋白质与单体的摩尔比并调控产物的流体动力学尺寸，具体对应关系见表4；

25、5、制备过程主要包括缓冲液反应、氮气脱氧、室温聚合、透析和凝胶过滤，工艺条件相对温和，所需设备通用。

26、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

1.一种单酶纳米凝胶包封漆酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，丙烯酰胺与n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为6∶1。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，碳酸钠缓冲液的浓度为20mm，ph为9.15。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，将n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜中，并按每摩尔蛋白质赖氨酸残基对应20当量的n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺加入漆酶溶液。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，丙烯酰胺的终浓度为200mm；n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的终浓度为33mm。

6.如权利要求2至5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述漆酶溶液的浓度为3.3-58.4μm。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤s3中，先采用pbs透析去除低分子量组分，再采用sephadex g-75凝胶过滤去除未包封漆酶和无蛋白聚合物。

8.一种如权利要求1所述的单酶纳米凝胶包封漆酶在制备造纸废水处理剂或木质素降解制剂中的应用。