一种高抗氧化活性沙棘原浆外泌体的保留制备方法及应用与流程

本发明属于植物源细胞外囊泡生物制备，具体涉及一种高抗氧化活性沙棘原浆外泌体的保留制备方法及应用。

背景技术：

1、沙棘是我国特色药食同源经济植物，其果实富含黄酮、多酚、生育酚、不饱和脂肪酸等多种天然抗氧化活性组分，具备清除自由基、抑制氧化应激、修复细胞氧化损伤的生物活性，在食品、化妆品、生物医药领域具有重要的应用开发价值。

2、沙棘原浆外泌体是沙棘果实天然分泌的30～150nm纳米级细胞外囊泡，能够特异性包裹沙棘核心抗氧化功效成分。相较于游离态的抗氧化活性组分，沙棘外泌体具有生物相容性好、细胞穿透性强、活性成分缓释稳定、生物利用度高的显著优势，是性能优良的天然抗氧化功能载体，具备较高的开发与应用价值。

3、当前沙棘外泌体的主流制备技术普遍存在工艺缺陷，现有制备方案多依赖常温高速超离心、高温减压浓缩、有机溶剂萃取的工艺路线，在实际生产与产品应用中暴露出多重技术弊端：高速超离心过程产生的强机械剪切力会撕裂外泌体囊泡结构，导致囊泡内部包裹的抗氧化活性成分泄露流失，直接降低产品有效成分含量；高温浓缩处理会造成黄酮、多酚等热敏性抗氧化组分发生不可逆降解，大幅削弱产品的抗氧化生物活性；有机溶剂萃取工艺存在化学试剂残留风险，不符合食品、化妆品及生物医药辅料的安全合规要求，严重限制了沙棘外泌体产品的应用场景拓展。

4、与此同时，现有技术未针对沙棘外泌体的囊泡结构特性与活性组分的理化特点设计专属的护活稳定体系，使得外泌体在制备全过程及后续储存环节中，易发生囊泡结构坍塌、活性组分氧化失活的问题。最终制得的沙棘外泌体产品普遍存在纯度低、生物活性差、批次质量稳定性弱、常温储存周期短等缺陷，无法满足工业化高品质量产的实际需求。

5、经全面检索国内外专利文献、核心学术期刊及公开发表的技术资料，现有技术中尚未披露低温梯度除杂、低压分级超滤、专属等渗护活、低温冻干相耦合的一体化温和制备工艺，也未见通过全流程温和制备工艺定向高保留沙棘外泌体抗氧化活性的相关技术方案。综上，现有技术无法同时解决沙棘外泌体制备过程中囊泡结构破损、抗氧化活性衰减、产品储存稳定性差、安全合规性不足及难以规模化量产的多重技术难题。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种高抗氧化活性沙棘原浆外泌体的保留制备方法及应用，可广泛应用于皮肤抗氧化修护制剂、抗氧化功能性保健食品、机体氧化应激损伤修复药物辅料等多个领域，产品适配场景丰富，应用价值与市场空间突出。

2、本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种高抗氧化活性沙棘原浆外泌体的保留制备方法，包括如下步骤：

4、（1）低温无菌预处理除杂：选取无腐烂、无霉变、无病虫害的新鲜成熟沙棘鲜果，采用0～4℃无菌纯水清洗、沥干，在4～8℃无菌低温环境下低速破壁榨汁，得到粗制沙棘原浆；将所述粗制沙棘原浆置于4℃低温离心机中，采用梯度低速离心工艺，依次去除大颗粒固体残渣、油脂相杂质，收集中层澄清无菌水相滤液；

5、（2）低温低压分级超滤富集：将步骤（1）所得澄清滤液依次经0.45μm、0.22μm无菌微孔滤膜过滤除杂后，采用100～150kda超滤膜、2～6℃恒温、0.1～0.3mpa低压条件下进行超滤浓缩，收集膜截留液，获得沙棘外泌体粗提液；

6、（3）等渗稳态护活处理：将步骤（2）所得外泌体粗提液与无菌等渗活性保护缓冲液按体积比1:3～1:5混合均匀，4℃低温避光孵育30～60min，稳定外泌体囊泡膜结构，抑制抗氧化活性组分降解流失；

7、（4）低温真空冻干定型：将护活后的混合液于-40～-50℃预冻2～4h，随后在10～30pa真空度条件下真空冷冻干燥12～18h，密封保存，制得高抗氧化活性沙棘原浆外泌体冻干粉。

8、进一步的，步骤（1）中所述梯度低速离心工艺具体为：先以3000～4000r/min离心10～15min去除果肉纤维残渣，再以6000～8000r/min离心15～20min实现油脂相、水相、固体杂质三相分离，全程离心温度恒定为4℃。

9、进一步的，步骤（2）中采用截留分子量为120kda的超滤膜，超滤温度恒定为4℃，超滤压力恒定为0.2mpa。

10、进一步的，步骤（3）中所述无菌等渗活性保护缓冲液为ph7.0～7.4的磷酸盐缓冲体系，包含质量浓度0.85%～0.95%的氯化钠、0.02%～0.05%的抗坏血酸钠、0.01%～0.03%的海藻糖。

11、进一步的，步骤（4）中冻干完成后采用无菌高纯氮气填充密封，置于-20℃避光密闭环境储存，产品常温储存6个月抗氧化活性衰减率≤8%。

12、本发明还提供了一种高抗氧化活性沙棘原浆外泌体，由所述的保留制备方法制得，所述沙棘外泌体的粒径分布为30～150nm。

13、进一步的，所述沙棘外泌体的囊泡完整结构保留率≥92%，dpph自由基清除率≥88%，abts自由基清除率≥90%，超氧阴离子清除率≥85%。

14、本发明还提供了一种所述的高抗氧化活性沙棘原浆外泌体在制备具有抗氧化修护功效的产品中的应用。

15、进一步的，所述具有抗氧化修护功效的产品为皮肤抗氧化修护化妆品，所述沙棘外泌体冻干粉在化妆品基质中的添加质量比为0.5%～1%。

16、进一步的，所述具有抗氧化修护功效的产品为抗氧化功能性保健食品或机体氧化应激损伤修复药物辅料。

17、本发明有益效果在于：

18、本发明采用全低温纯物理耦合制备工艺，全程规避高速超离心产生的强机械剪切损伤、高温浓缩导致的热敏组分降解以及有机溶剂萃取带来的化学试剂干预，从制备全流程保护沙棘外泌体的完整囊泡结构，锁定其内部包裹的黄酮、多酚、维生素等核心抗氧化活性组分，相较于传统制备工艺，可实现沙棘外泌体囊泡完整结构保留率≥92%，有效避免囊泡破损引发的活性成分泄露流失，产品对dpph自由基、abts自由基、超氧阴离子自由基的清除能力均得到显著提升，整体抗氧化活性较传统工艺提升40%以上，充分发挥了沙棘外泌体作为天然抗氧化纳米载体的生物活性优势。

19、本发明通过梯度低速离心除杂与分级低压超滤富集的耦合纯化路径，可逐级去除果肉纤维残渣、油脂相杂质及微细颗粒物，有效提升外泌体产品的纯度与粒径均一性；同时搭配适配沙棘外泌体生理环境的专属等渗活性保护缓冲体系，配合低温真空冻干与无菌密封储存工艺，能够稳定外泌体囊泡膜蛋白结构，抑制热敏性抗氧化组分的氧化降解，解决了传统工艺产品易发生结构坍塌、氧化失活、储存周期短的技术痛点，成品常温储存6个月的抗氧化活性衰减率低于8%，储存稳定性远优于现有技术产品，批次间性能波动小，可适配长距离运输与多场景存放需求。

20、本发明制备全过程不添加任何有机溶剂，无化学试剂残留风险，制备得到的沙棘外泌体温和无刺激、生物相容性好，完全符合化妆品、功能性食品、生物医药辅料的安全准入标准；相较于游离态的沙棘抗氧化组分，外泌体囊泡载体具备更强的细胞穿透能力与活性缓释效果，生物利用度更高，可广泛应用于皮肤抗氧化修护制剂、抗氧化功能性保健食品、机体氧化应激损伤修复药物辅料等多个领域，产品适配场景丰富，应用价值与市场空间突出。

21、本发明工艺步骤清晰、参数可控、重复性强，全部工序均可依托通用生物制备设备完成，无需依赖高速超离心机等专用高价设备，大幅降低了生产投入成本与操作门槛；相较于传统高速超离心工艺产量低、处理量小、批次稳定性差的局限，本工艺可实现工业化连续稳定量产，且限定的工艺参数区间具备良好的容错性，生产过程中常规参数波动不会显著影响产品性能，量产批次稳定性强，具备极强的工业实用性与产业化推广价值。