毛地黄毒苷配基的酶合成方法

本发明属于人工合成，涉及毛地黄毒苷配基的酶合成方法。

背景技术：

1、(+)-毛地黄毒苷配基（digitoxigenin）是玄参科毛地黄属植物中强心苷的核心苷元，属于甾体类化合物，是毛地黄毒苷（digitoxin）去掉糖基后的活性母核。作为一种广发使用的强心苷类药物，在临床上主要用于治疗充血性心力衰竭，心房颤动等疾病。

2、该化合物于1996年由美国著名化学家gilbert stork等人以29步不对称全合成成功首次合成出来（j. am. chem. soc. 1996, 118, 10660-10661）。近年来，强心苷类化合物的合成也引起了生物合成的关注。戈课题组、瞿和周课题组在强心甘类化合物的化学-酶法方面取得了重大突破，他们分别对植物和微生物的p450酶进行了筛选和验证，得到了c-14α羟化酶，通过消除和水合反应，实现了c-14位α羟基向c-14位β羟基的转化，进而完成了该化合物的合成（acs catal. 2022, 12, 9839; nat synth. 2023: doi.org/10.1038/s44160-023-00280-z））。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种毛地黄毒苷配基的酶合成方法。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明中使用到的酶来源于已公开的专利（申请公布号：cn118360264a）。

3、本发明提供一种毛地黄毒苷配基的酶合成方法，具体步骤如下：

4、s1：将化合物3溶于dmf溶剂，并将其加入重旋菌体，30℃，250 rpm 条件下反应，旋蒸除去溶剂，所得粗品用硅胶柱层析进行纯化得到白色固体化合物4，其化学反应式如下：

5、；

6、所述菌体含有甾体c15 α 羟化酶；

7、s2：将化合物4溶于无水甲苯中，然后加入burgess试剂，加热至100℃并搅拌1小时，冷却至室温后，用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到化合物5，其化学反应式如下：

8、；

9、s3：将化合物5、乙酰丙酮钴加入圆底烧瓶中，在氧气氛围下加入无水异丙醇，搅拌5分钟后，滴加苯基硅烷，反应在室温下搅拌6小时，向混合物中加入饱和na2s2o3溶液并搅拌30分钟，用乙酸乙酯萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，通过硅胶柱色谱法，得到化合物6和化合物7，其化学反应式如下：

10、；

11、s4：将化合物6和5% pd/c加入圆底烧瓶中，在氮气氛围下加入甲醇，然后置换为氢气，所得混合物在室温下搅拌6小时，反应结束后，混合物用硅藻土过滤，并用乙酸乙酯冲洗，然后在减压下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到化合物8，其化学反应式如下：

12、；

13、s5：氮气保护下，将化合物8溶于无水四氢呋喃中，随后将温度降至 -78℃，逐滴加入浓度为1m的三仲丁基硼氢化锂，混合物在-78℃下搅拌 15分钟，然后加入饱和氯化铵溶液淬灭，然后用乙酸乙酯萃取，并用饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，通过硅胶柱层析进行纯化，得到化合物9为所述毛地黄毒苷配基，其化学反应式如下：

14、；

15、优选的，所述化合物3的合成方法如下：

16、化合物2和ph3p=c=c=o加入干燥的圆底烧瓶中，在氮气保护下加入甲苯，随后缓慢滴加三乙胺，将所得反应混合物加热至110℃并搅拌反应2小时，反应结束后，将混合物冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，通过硅胶柱层析纯化，得到化合物3，其化学反应式如下：

17、。

18、优选的，所述化合物2的合成方法如下：

19、将化合物1置于圆底烧瓶中，在氮气保护下加入无水乙腈，将反应体系冷却至-20℃，搅拌至底物完全溶解后，缓慢滴加三甲基碘硅烷，反应在-20℃下持续进行4小时，反应完成后，加入饱和硫代硫酸钠溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯稀释反应混合物，并用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤后，在减压条件下浓缩，通过硅胶柱色谱法纯化，得到化合物2，其化学反应式如下：

20、；

21、优选的，

22、步骤s1中，化合物3与 dmf溶剂的比为1g: 3ml；

23、步骤s2中，化合物4：无水甲苯：burgess试剂为29mg：1ml: 28mg；

24、步骤s3中，化合物5：乙酰丙酮钴：无水异丙醇为36 mg：31 mg：1 ml；

25、步骤s4中，化合物6：pd/c：甲醇为25 mg：2.5mg：1 ml；

26、步骤s5中，化合物8：无水四氢呋喃为75 mg：4 ml；

27、优选的，

28、步骤s1中，纯化流动相二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为30:1；

29、步骤s2中，纯化流动相二氯甲烷和乙酸乙酯体积比为 15:1；

30、步骤s3中，纯化流动相二氯甲烷和乙酸乙酯体积比为4:1；

31、步骤s4中，纯化流动相二氯甲烷和乙酸乙酯体积比为4:1；

32、步骤s5中，纯化流动相石油醚和乙酸乙酯体积比为1:1。

33、优选的，所述化合物2、ph3p=c=c=o、甲苯、三乙胺的比值为10.6 mmol： 21.2mmol： 100 ml： 4.42 ml，纯化流动相为石油醚和乙酸乙酯的体积比为2:1。

34、优选的，所述化合物1、无水乙腈、三甲基碘硅烷的比值为14.4 mmol： 200 ml：57.8 mmol，纯化流动相为石油醚和乙酸乙酯的体积比为 2:1。

35、本发明的有益效果在于：

36、1、原料廉价易得：

37、本发明采用价格低廉、易得的甾体化合物——皮甾酮作为起始原料，相比于传统全合成方法中使用的复杂或昂贵的原料，显著降低了生产成本，有利于工业化生产。

38、2、合成路线简短高效：

39、相比于1996年gilbert stork等人报道的29步不对称全合成，本发明通过化学-酶法策略，显著缩短了合成步骤。从原料到最终产物，仅需少量化学转化与关键酶催化反应即可完成，提高了合成效率。

40、3、立体选择性高：

41、利用特异性酶（cyp68j3_yni_sc酿酒酵母菌株）催化氧化反应，能够立体专一性地引入c-15位α羟基，避免了传统化学氧化中可能产生的多种异构体，减少了分离纯化的难度，提高了目标产物的纯度。

42、3、后处理简单，便于纯化：

43、由于采用了静态酵母细胞转化体系，减少了微生物自身代谢产物的干扰，结合简单的硅胶柱层析纯化即可获得高纯度的中间体及终产物，简化了后处理流程。

44、4、提高了原子经济性与中间体利用率：

45、在c-14位羟基的构建过程中，通过消除反应与mukaiyama水合反应的组合策略，使得c-14位α异构体可进一步转化为β构型目标产物，有效提高了关键中间体的利用率，减少了副产物的生成。

46、5、总产率较高：

47、在多步转化中，各步反应均获得了良好的产率，最终实现了天然产物毛地黄毒苷配基的高效全合成。

48、6、具备工业化应用潜力：

49、整体方法操作简便、条件温和（如-20℃至室温、常压反应等），且部分步骤可采用静息细胞生物转化，具备放大生产的可行性，为强心苷类药物核心苷元的工业化合成提供了新的技术路径。

50、综上所述，该技术方案在原料成本、合成步骤、立体选择性、产物纯化效率及整体产率等方面均具有显著的有益效果。

51、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。