一种识别肼的比率型荧光探针及其制备方法和应用

本发明涉及荧光探针，特别涉及一种识别肼的比率型荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肼（n2h4）是一类兼具强还原性与高毒性的含氮化合物，作为重要的精细化工原料，广泛应用于农药合成、医药中间体制备、火箭推进剂、锅炉水脱氧处理以及电镀工业等领域。肼可通过皮肤接触、呼吸道吸入以及饮食摄入等多种途径进入人体，短期高浓度暴露可引发急性中毒，长期低剂量接触会对肝脏、肾脏、肺部及中枢神经系统造成不可逆损伤，甚至具有致癌风险，已被多个国家和国际组织列为优先控制污染物。因此，开发快速、灵敏、高选择性且便捷的痕量肼检测方法，对于环境风险管理、食品安全保障与人体健康防护具有重大的研究意义与应用价值。

2、然而，现存的许多用于检测肼的技术手段存在明显缺陷，包括依赖大型精密仪器、样品前处理繁琐、分析周期长、难以实现现场快速检测与活体原位成像等，这些缺陷很大程度上限制了其在实际复杂体系中的应用。如中国发明专利申请 cn 115215826 a 公开了一种检测水合肼的aie型荧光探针。该发明以三苯胺衍生物为荧光团构建检测水合肼的荧光探针，但是该探针为单波长荧光增强型，检测信号易受探针浓度、仪器参数与微环境波动的干扰，定量检测准确性不足；且荧光发射峰位于短波区域，斯托克斯位移小，容易受到背景荧光的干扰，不利于用于复杂样品检测与生物成像。

3、荧光探针技术兼具操作简便、响应快速、灵敏度高、选择性好、检出限低等优势，可实现可视化检测、原位成像与实时在线监测，已成为环境污染物与生物活性分子痕量传感领域的研究热点。相比于传统单波长荧光探针，比率型荧光探针通过记录两个特征波长处的荧光强度比值来识别目标分子，可有效消除外界干扰，显著提升检测的准确性与可靠性。

4、目前已报道的比率型肼荧光探针仍然存在一些问题，包括灵敏度不足、响应速度慢、斯托克斯位移小、ph适用范围窄、生物相容性与膜穿透性能差等，导致这些探针在实际检测与生物成像应用中的效果并不理想。如中国发明专利申请 cn 121991030 a 公开了一种用于检测肼的比率型荧光探针。该发明基于荧光共振能量转移机制构建双发射比率响应，但是该探针分子结构复杂、合成步骤繁琐，且斯托克斯位移较小，激发光与发射光易发生重叠，背景干扰严重；同时探针检出限较高，响应动力学缓慢，无法实现痕量肼的快速高灵敏检测，且细胞膜穿透能力有限，难以应用于活细胞共聚焦荧光成像。

技术实现思路

1、为了克服现有肼荧光探针灵敏度不足、易受环境干扰、光学性能与生物相容性有待提升的问题，本发明的目的在于提供一种识别肼的比率型荧光探针的制备方法，合成步骤清晰，反应条件温和，产物处理过程简便，易于操作与放大制备。

2、本发明的另一目的在于提供一种识别肼的比率型荧光探针及其应用，对肼检出限低、选择性好、抗干扰能力强，且具有大斯托克斯位移与宽ph适用范围，应用于光谱检测中准确度高，应用于细胞共聚焦荧光成像中背景干扰小、成像效果优异。

3、本发明的目的通过以下技术方案实现：

4、本发明提供一种识别肼的比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

5、（1）制备第一中间体

6、将环己酮和n,n-二甲基甲酰胺加入到三氯甲烷中，氮气保护下，冷却到 2~-2℃，加入三溴化磷，升温至室温反应8~12 h，加入冰水终止反应，调节ph 至中性，二氯甲烷萃取，有机层经过无水硫酸镁干燥并浓缩得到粗产物，得到黄色油状第一中间体；

7、（2）制备第二中间体

8、将第一中间体与4-溴-2-羟基苯甲醛加入到n,n-二甲基甲酰胺中，加入碳酸铯，室温下反应8~12 h，待反应结束后，乙酸乙酯稀释，水洗数次，有机相干燥浓缩得到粗产物，经柱层析法纯化得到黄色固体第二中间体；

9、（3）制备第三中间体

10、将1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯乙烯与苯胺加入到甲苯中，以三 (二亚苄基丙酮)二钯为催化剂，加入叔丁醇钠，氮气保护下，115~125℃反应18~22h，待反应结束后，减压浓缩，三氯甲烷溶解，水洗收集有机相，无水硫酸钠干燥，经柱层析法纯化得到黄色固体第三中间体；

11、（4）制备第四中间体

12、将第二中间体与第三中间体加入到1,4-二氧六环中，以三 (二亚苄基丙酮) 二钯为催化剂，加入davephos配体和碳酸铯，氮气保护下，90~100℃反应16~20 h，待反应结束后，减压蒸发溶剂，经柱层析法纯化得到黄色固体第四中间体；

13、（5）制备荧光探针

14、将第四中间体与丙二腈溶于无水乙醇，以哌啶为催化剂，室温反应3.5~4.5h，待反应结束后，过滤，固体经无水乙醇洗涤重结晶、干燥得到所述识别肼的比率型荧光探针。

15、在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，所述的环己酮和三溴化磷的摩尔比为1∶2.5~3。

16、在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，所述的第一中间体和4-溴-2-羟基苯甲醛的摩尔比为3.5~4∶1；所述碳酸铯和4-溴-2-羟基苯甲醛的摩尔比为1.8～2.2∶1。

17、在本发明的一些实施例中，步骤（3）中，所述的1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯乙烯与苯胺的摩尔比为1∶1.2~1.4；所述三(二亚苄基丙酮)二钯与1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯乙烯的摩尔比为0.010~0.015∶1；所述叔丁醇钠与1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯乙烯的摩尔比为1.2~1.6∶1。

18、在本发明的一些实施例中，步骤（4）中，所述的第二中间体与第三中间体的摩尔比为1∶1。

19、在本发明的一些实施例中，步骤（2）中柱层析法分离第二中间体时的洗脱液为正己烷∶二氯甲烷 = 5∶1，v/v；步骤（3）中柱层析法分离第三中间体时的洗脱液为正己烷∶二氯甲烷 = 9∶1，v/v；步骤（4）中柱层析法纯化第四中间体时的洗脱液为正己烷∶乙酸乙酯 =1∶1，v/v。

20、在本发明的一些实施例中，步骤（5）中，所述的第四中间体与丙二腈的摩尔比为1∶3~4；所述哌啶与无水乙醇的体积比为0.01～0.03∶1。

21、本发明还提供了一种识别肼的比率型荧光探针，具有如下结构：

22、。

23、在本发明的一些实施例中，所述的识别肼的比率型荧光探针检出限为16.3 nm，探针反应前后斯托克斯位移分别为100 nm与106 nm。

24、本发明还提供了所述的识别肼的比率型荧光探针在光谱检测、共聚焦荧光成像中的应用。

25、本发明的识别肼的比率型荧光探针采用d–π–a型分子结构，以四苯乙烯衍生物为电子给体、氧杂蒽结构为共轭桥、丙二腈为识别基团与电子受体，基于分子内电荷转移（ict）效应实现对肼的特异性识别。与肼发生亲核加成-消除反应后，探针分子共轭结构发生变化，ict效应减弱，荧光由红色变为黄色，呈现显著的比率型光学响应。

26、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

27、（1）本发明的识别肼的比率型荧光探针的制备方法，合成步骤清晰，反应条件温和，产物处理过程简便，易于操作与放大制备。

28、（2）本发明的识别肼的比率型荧光探针，对肼检出限低、选择性好、抗干扰能力强，且具有大斯托克斯位移与宽ph适用范围。

29、（3）本发明的识别肼的比率型荧光探针，应用于光谱检测中准确度高，应用于细胞共聚焦荧光成像中背景干扰小、成像效果优异。