一种线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针及其制备方法和应用

本发明涉及荧光探针，尤其涉及一种线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、蛋白质s-棕榈酰化是一种动态可逆的翻译后修饰，调控蛋白的膜亲和力、定位与功能，因此棕榈酰化循环在调控细胞内蛋白质表达或调控信号通路平衡过程中发挥关键作用。参与棕榈酰化循环的酶和底物蛋白质已成为潜在的治疗靶点，研究蛋白质棕榈酰化和去棕榈酰化过程对研究疾病和治疗有重要意义。

2、传统代谢标记或质谱方法无法实时监测去棕榈酰化酶活性，发展时空分辨的活细胞酶成像工具，对于深入研究酶活性动态调控至关重要。小分子荧光探针是实现动态监测酶活性的理想方案，相较于“点亮型”荧光探针，比率型荧光探针凭借其自校准能力，在检测准确性、抗干扰性和定量能力上表现突出，特别是面对复杂的组织样本时因稳定、可靠的内参信号而更具应用优势。同时，不同细胞区室中的去棕榈酰化酶参与调控各异的信号通路，而经棕榈酰化修饰的荧光探针则易富集于高尔基体。为检测限定区室中去棕榈酰化酶，需要在荧光探针结构上负载细胞器靶向能力。

3、目前满足需求的酶响应探针极为稀少，亟需开发一种用于活细胞线粒体区域的比率型荧光探针，用于动态监测去棕榈酰化酶活性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针及其制备方法和应用，以解决现有检测技术无法实时监测酶活性、探针摄取分布不均及响应精确性差等问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针，所述二氟化硼类姜黄素荧光探针通过比率信号响应细胞线粒体中去棕榈酰化酶活性；

4、所述二氟化硼类姜黄素荧光探针的结构式为：

5、；

6、其中，r1包括-ch2cn或；r2包括-h、或，n为5~13的任一整数。

7、本发明还提供了所述线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针的制备方法，包含如下步骤：

8、1）化合物a、碘甲烷和氢化钠在有机溶剂中进行取代反应，得到化合物b；

9、2）化合物b、缩合试剂、活化剂、甲氨盐酸盐和n,n-二异丙基乙胺在有机溶剂中进行缩合反应，得到化合物c；

10、3）化合物c和三氟乙酸在有机溶剂中进行酸解反应，得到化合物d；

11、4）乙酰丙酮和三氟化硼乙醚混合后进行络合反应，得到化合物e；

12、4-羟基苯甲醛、碳酸钾和3-溴丙炔在有机溶剂中进行取代反应，得到化合物f；

13、5）化合物e、化合物f和有机碱在有机溶剂中进行加成反应，得到化合物g；所述有机碱为哌啶；

14、6）化合物g、对羟基苯甲醛、硼酸三丁酯和正丁胺在有机溶剂中进行加成反应，得到化合物h；

15、7）化合物d、化合物h、三光气、三乙胺、辛酰氯和三氟乙酸在有机溶剂中进行缩合反应，得到化合物j；

16、8）化合物j、4-叠氮丁基三苯基溴化膦和碘化亚铜在有机溶剂中进行叠氮-炔环加成反应，得到二氟化硼类姜黄素荧光探针；

17、所述化合物a~化合物j的结构式为：

18、

19、

20、；

21、化合物j中，r2包括-h、或，n为5~13的任一整数。

22、作为优选，步骤1）所述化合物a、碘甲烷和氢化钠的摩尔比为4~5：17~18：12.5~13.5；所述取代反应的时间为5~7h；

23、步骤2）所述缩合试剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺，所述活化剂为1-羟基苯并三唑；所述化合物b、缩合试剂、活化剂、甲氨盐酸盐和n,n-二异丙基乙胺的摩尔比为1.6~2.5：2.7~3.6：2.8~3.6：5.8~6.8：1.8~2.6。

24、作为优选，步骤3）所述化合物c和三氟乙酸的摩尔体积比为0.63~0.73mmol：1~1.5ml；所述酸解反应在氩气气氛下进行，酸解反应的时间为3~5h。

25、作为优选，步骤4）所述乙酰丙酮和三氟化硼乙醚的摩尔比为0.8~1.2：1；所述络合反应的温度为55~65℃；

26、所述4-羟基苯甲醛、碳酸钾和3-溴丙炔的摩尔比为3.6~4.6：5.7~6.7：5.7~6.7；所述取代反应在氮气气氛下进行，取代反应的时间为3~5h。

27、作为优选，步骤5）所述化合物e和化合物f的摩尔比为13~14：7.6~8.6；所述加成反应的时间为0.5~1.5h，加成反应在冰浴条件下进行；

28、步骤6）所述化合物g、对羟基苯甲醛和硼酸三丁酯的摩尔比为0.78~0.88：0.8~1.5：0.15~0.25；化合物g和正丁胺的摩尔体积比为0.78~0.88mmol：0.01~0.02ml；所述加成反应在氩气气氛下进行，加成反应的时间为11~13h。

29、作为优选，步骤7）所述化合物d、化合物h、三光气和辛酰氯的摩尔比为0.34~0.44：0.34~0.44：0.34~0.44：0.4~0.5；化合物d和三氟乙酸的摩尔体积比为0.34~0.44mmol：1.7~2.6ml；

30、步骤8）所述化合物j、4-叠氮丁基三苯基溴化膦和碘化亚铜的摩尔比为3~5：3~5：6~10；所述叠氮-炔环加成反应在避光条件下进行，叠氮-炔环加成反应的时间为20~28h。

31、本发明还提供了所述线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针在制备区分性响应去棕榈酰化酶的试剂中的应用。

32、作为优选，线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针在制备响应细胞线粒体去棕榈酰化酶的试剂中的应用。

33、本发明的有益效果：

34、本发明的线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针的合成以n-(叔丁氧羰基)-s-三苯甲基-l-半胱氨酸为原料，由取代反应、缩合反应、酸解反应得到半胱氨酸中间体；以乙酰丙酮为原料，由络合反应、加成反应得到二氟化硼类姜黄素中间体；两者再通过异氰酸酯缩合反应和叠氮-炔环加成反应得到二氟化硼类姜黄素荧光探针。

35、本发明的s-dfb-tpp探针以二氟化硼类姜黄素染料为荧光单元，连接去棕榈酰化酶特异性识别单元和线粒体靶向单元，能够特异性富集于活细胞线粒体区域，被去棕榈酰化酶激活后产生比率型荧光信号，实现对该酶活性的实时动态监测。本发明解决现有检测技术无法实时监测酶活性、探针分布不均及响应精确性差的问题，为线粒体区室去棕榈酰化酶的活性可视化分析提供了高效工具，可用于疾病机制研究及药物筛选。

1.一种线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针，其特征在于，所述二氟化硼类姜黄素荧光探针通过比率信号响应细胞线粒体中去棕榈酰化酶活性；

2.权利要求1所述线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1）所述化合物a、碘甲烷和氢化钠的摩尔比为4~5：17~18：12.5~13.5；所述取代反应的时间为5~7h；

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤3）所述化合物c和三氟乙酸的摩尔体积比为0.63~0.73mmol：1~1.5ml；所述酸解反应在氩气气氛下进行，酸解反应的时间为3~5h。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4）所述乙酰丙酮和三氟化硼乙醚的摩尔比为0.8~1.2：1；所述络合反应的温度为55~65℃；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤5）所述化合物e和化合物f的摩尔比为13~14：7.6~8.6；所述加成反应的时间为0.5~1.5h，加成反应在冰浴条件下进行；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤7）所述化合物d、化合物h、三光气和辛酰氯的摩尔比为0.34~0.44：0.34~0.44：0.34~0.44：0.4~0.5；化合物d和三氟乙酸的摩尔体积比为0.34~0.44mmol：1.7~2.6ml；

8.权利要求1所述线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针在制备区分性响应去棕榈酰化酶的试剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，线粒体靶向-去棕榈酰化酶激活型二氟化硼类姜黄素荧光探针在制备响应细胞线粒体去棕榈酰化酶的试剂中的应用。